Circulation 单细胞测序揭示多种器官内皮细胞转录图谱
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【DOI】10.1161/CIRCULATIONAHA.119.041433
背景
血管内皮细胞(ECs)因其所在的血管和组织的不同而表现出相当大的功能异质性。虽然这些功能差异可能印记在转录组中，但维持EC异质性的途径和网络还没有完全被描绘出来。
方法
为了研究EC特异性的转录基础，我们分析了Tabula Muris数据库中的组织特异性小鼠内皮细胞(ECs)的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据。我们使用了许多生物信息学工具来从scRNA-seq数据中发现EC异质性的标记和来源。
结论
总之，我们使用Tabula Muris数据库中的scRNA-seq数据来揭示维持组织特异性EC的转录网络，并确定组织特异性EC之间新的血管分泌和功能关系。
临床视角
有什么新的发现：
我们从不同的小鼠组织中确定了特征标记、转录网络、血管分泌信号通路和富含内皮细胞的细胞亚群。
我们发现了组织特异性内皮基因表达的性别差异。
我们发现组织特异性内皮细胞的标记在小鼠和人类之间是保守的。
有什么临床意义？
新型内皮细胞膜表面标志物可作为组织特异性给药靶点。 男性和女性组织特异性内皮细胞之间的差异表达基因可以被用来开发性别特异性心血管疾病模型和治疗方法。
前言
内皮细胞(ECs)构成血管和淋巴管的最内层。ECs通过调节血液流动、血浆大分子的输送、血管形成和循环血细胞的黏附，在组织内稳态中发挥关键作用。因此，ECs功能障碍可能导致多种疾病机制，包括动脉粥样硬化和冠状动脉疾病、肿瘤血管化、糖尿病并发症和神经退行性疾病。例如，血-脑屏障中的内皮功能障碍可导致阿尔茨海默病、癫痫和多发性硬化症。肺内皮细胞分泌血管分泌因子被证明可以促进肺泡再生，而肝窦内皮细胞分泌的血管分泌因子在调节肝脏再生方面起着关键作用。因此，了解组织特异性EC功能对于治疗广泛的人类疾病至关重要。
基于批量微阵列的小鼠和人ECs的转录分析，以及对人胎儿ECs的批量RNA测序，已经证明来自不同组织的ECs具有独特的基因表达谱。然而，批量检测不能解决特定组织内皮细胞之间可能存在的转录异质性。除了来自不同血管类型(即动脉、静脉)的ECs外，组织内可能还有一些尚未确定的内皮细胞亚群。
最近出现的scRNA-seq解决了这一局限，它允许以前所未有的分辨率对数千个单细胞进行深入的转录分析。Tabula Muris数据库分析了来自20个小鼠器官和组织的10万多个细胞的scRNAseq数据，构建了整个生物体的转录图谱。
结果
一、 小鼠12个器官的单细胞转录数据中内皮细胞的鉴定
我们从Tabula Muris数据库中提取了12个器官(脂肪组织、主动脉、脑、横隔膜、心脏、肾脏、肝脏、肺、乳腺、胰腺、骨骼肌和气管)的单个EC的转录组数据，其中有足够数量的ECs用于下游分析(图1)。我们观察到scRNA-seq和基于微阵列的组织特异性EC基因表达之间有很强的相关性，表明scRNA-seq可以有效地从异质细胞混合物中捕获组织特异性EC转录特征。
为了更好地解决组织特异性内皮细胞之间的差异，我们在二维t-SNE空间中单独可视化了内皮细胞(图2B)。使用这种方法，我们观察到大多数内皮细胞是基于起源的组织分离的。来自一些器官(例如脑、肾、肺和肝脏)的ECs似乎具有独特的转录特征，而来自其他器官(例如脂肪、心脏和主动脉)的ECs则显示出更多的基因表达重叠，如UMAP所示(图2C)。
图2
为了定义组织特异性ECs的标记，我们使用非参数Wilcoxon秩和检验从12个器官中的每一个器官中鉴定了ECs富含的转录本。为了可视化DEGs的组织特异性，我们制作了一张热图，显示了所有12个器官中组织特异性DEGs的表达。在t-SNE中可以看到 (图2B)，脑和肝ECs表达了一组独特的基因，这些基因在其他器官的ECs中几乎没有被检测到(图3)。相反，心脏、横隔膜、脂肪组织、骨骼肌和乳腺ECs的特征性较差(图3)。
利用鉴定出的器官特异性EC的DEGs，我们通过KEGG数据库进行基因集富集分析，确定器官特异性ECs特有的分子通路。在12个器官中的每个器官ECs中富集最多DEGs的通路被进行可视化(图4)。独特的通路例如：脂肪组织ECs中的破骨细胞分化，脑ECs中的ErbB信号，心脏ECs中的轴突引导，以及肾ECs中的内吞作用。我们确定了每个器官ECs中与MAPK信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用和代谢途径相关的独特的特异性DEGs。
图4
已知的ECs在组织内稳态和功能中的一个主要作用是通过分泌EC特有的旁分泌因子(称为“血管分泌”因子)来调节的。因此，我们试图揭示每个器官中ECs独特表达的血管分泌因子。从EC单细胞转录组中，我们确定了EC与12个器官中每个器官中所有实质细胞之间潜在的配体-受体对 (图5B，左)。这一分析揭示了在每个器官的ECs和实质细胞之间存在独特的血管分泌配体-受体配对。例如，在脑ECs中表达的Efna1，与神经元和少突胶质前体细胞中的EPHA5和Pehb5基因编码受体结合，而Edn3与脑周细胞中的Ednra相互作用。同样，我们描绘了8个主要器官独特的血管分泌和旁分泌的关系(图5B，右)。
我们利用非监督聚类来识别可能独立于起源组织的新的ECs亚群。具体地说，我们使用graph-based的聚类方法发现了13个独特的类群(图6A，B)。某些簇显示来自单个器官的ECs的富集，而另一些簇由来自不同器官的ECs组成(图6C)。相反，我们分析了各器官内的ECs被分配到不同的类群中比例和数量(图6D)。通路富集分析和每簇特定的DEGs使我们能够推断出非监督簇的生物学特性(图6E-G)。例如，第4簇是肺ECs的一个亚群，它过度表达涉及抗原处理和递呈、同种异体排斥反应和移植物抗宿主病的转录本，所以我们假设这个亚群可能代表抗原递呈的ECs。
综上所述，我们将scRNA-seq与无监督聚类相结合，以确定存在于单个器官或多个器官中的EC亚型。
Tabula Muris数据库收录了雄性和雌性小鼠的数据，我们探索了脑、心、肺、脂肪组织、主动脉和肾脏中，性别相关的EC基因的表达(图5A)。为了确定性别对EC基因表达的影响，我们进行了非监督聚类，以确定EC是否在给定器官内按性别聚集(图SIX)。一些组织(例如，主动脉、脑、肺)的ECs亚群几乎全部由单一性别的ECs组成，而其他组织(脂肪组织、心脏、肾脏)在亚群之间的性别分布更为均匀。这些发现表明，在某些组织中存在性别特异性的ECs亚群。我们还测定了男性和女性器官特异性ECs中排名靠前的DEGs(图5B)，并用它们进行通路富集分析(图5C)。对男性和女性组织特异性ECs中鉴定的DEGs进行交集分析，表明DEGs的性别依赖性在不同的组织中有所不同。
值得注意的是，我们发现Lars2，一个编码亮氨酰-tRNA合成酶2的非性别连锁基因，在所有男性ECs中一致高表达，而它在女性ECs中的表达水平很低而且可变性很大(图8A-B)。虽然Lars2基因在各种细胞类型中的表达相对普遍，但LARS2蛋白的表达似乎主要是大多数器官中的ECs所特有的(图8C)。与mRNA类似，LARS2蛋白在雄性ECs中表达很高，特别是在脑、心脏、心室、肺和肝脏中(图8C)。
为了确定我们在小鼠ECs中的发现与人类内皮生物学的相关性，我们首先将从人类胎儿器官(例如心、肾、肝和肺)分离的ECs的批量RNA-seq数据与Tabula Muris数据库进行了比较。我们发现，当比较来自同一器官的ECs时，成年小鼠和胎儿人类EC基因表达的相关性往往最强(图9A)。此外，在小鼠中鉴定出的组织特异性ECs的标记物也在相应的人类组织特异性ECs中表达很高(图9B)。
结果讨论
在这个数据库中，我们从12个器官中提取了单独的EC转录组数据，以研究组织特异性ECs的转录图谱。利用这些转录组数据，我们确定了富含组织特异性ECs的标志物、信号通路和生物学过程。重要的是，我们发现小鼠组织特异性ECs的标志物在人胎儿ECs中是保守的。
此外，我们使用一种无监督的聚类方法来识别新的EC亚型。我们还推测了潜在的旁分泌EC与实质细胞的相互作用以及EC基因表达的性别差异。最后，我们观察到Lars2在雄性小鼠ECs中有较强的表达，但在雌性小鼠ECs中的表达水平很低且是易变的。
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原文链接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32929989
文：盼盼
排版：市场部