单细胞转录组+空间转录组揭示人类心脏发育过程中整个器官的空间基因表达和细胞图谱

本文提出了一种可以揭示人类胚胎心脏在4.5-5PCW、6.5PCW和9 PCW三个发育时期的不同部位细胞的综合的转录表达情况，并将细胞特定表达的基因匹配到特定的组织解剖区域的研究方法。空间转录组技术（ST）揭示了人类胚胎心脏在每个发育阶段对应的不同解剖区域的独特的基因表达图谱；单细胞RNA测序（scRNA）技术鉴定人胚胎心脏细胞类型，证实并丰富了ST技术对胚胎心脏基因表达的空间注释；然后又通过原位测序技术进一步验证和完善这些结果，从而得到了人类胚胎心脏三个发育阶段的空间亚细胞图谱；期望最终可以生成一个人类心脏发育的公共网络资源，以促进未来人类心脏发育过程的进一步研究。

心脏是人类胚胎中第一个有功能的实体器官，它的发育过程非常复杂。大量研究发现其起源于中胚层，发育成心管，在受孕后21天左右开始跳动。大约在30天后发育形成4个独立的心腔和心外膜。随后心室出口道（outflow tract，OFT）分化，心室心肌的外部部分转化为致密的心肌和隔膜；最后OFT分裂形成主动脉和肺动脉，大部分心脏间隔在妊娠前三个月结束时已经完成分化。虽然我们对人类心脏发育有大致的了解，但是对其具体发育过程尚不完全清楚。

   因此，本文结合空间转录组测序（ST）、单细胞测序（scRNA-seq）和原位测序（ISS）等技术对胚胎心脏发育进行研究。通过对胚胎心脏细胞异质性、细胞类型、空间位置等结果进行研究和细化，期望可以生成一个人类心脏发育的公共网络资源，以促进未来人类心脏发育过程的进一步研究。

材料：4.5-5、6.5和9 PCW 三个时期的人类发育心脏组织

方法：空间转录组测序（ST）、单细胞测序（scRNA-seq）、和原位测序（ISS）、smFISH

1. 人类心脏发育过程中基因的时空动态表达

作者最初通过免疫组化（IHC）对孕后4.5-5PCW，6.5PCW和9 PCW的人类胚胎心脏样本进行组织切片和染色，能够清楚地揭示人类心脏发育过程中不同时期和部位的蛋白表达模式。IHC使用的是一组预选抗体，对后续研究具有一定的局限性，采用ST技术来探索人类心脏发育过程中不同时期和部位的基因表达情况有效的避免了这种局限。作者从三个阶段心脏组织中收集组织切片进行ST实验。得到数据集由3115个spot组成（每个spot可包含30个细胞），过滤后每个spot平均含有1700个基因和3800个转录本。皮尔逊相关性分析表明，每个阶段的切片之间以及不同时间段的切片之间相关系数都非常高，表明所有点在基因表达水平方面都具有可比性。因此作者对三个阶段的spot中所有基因表达数据进行了降维和聚类，共鉴定出10个空间保守簇，且这些簇均可匹配到特定的解剖区域。其中，主要的心肌区域(簇0、1、2、3和4)在所有时间点上是共享的，主要反映了心脏的生长发育，因为这些簇中的spot数量随着心脏的发育而增加。与其他两个发育时期相比，在4.5-5 PCW的组织中，心室出口道（outflow tract，OFT）和较大的血管(簇5)的含量很少，主要以AV间质(簇6)为主。另一方面，OFT、AV、纵隔间叶和心外膜(簇5、簇6、簇7和簇9)表现出相似的GO特征；它们与细胞外基质和不同程度的血管和动脉形态形成有关。簇5、6和7富含心脏瓣膜和膈膜发育的相关特征。此外，含有血液和免疫细胞的空腔(簇8)主要存在于6.5PCW时期的组织，这时期的组织比其他两个发育时期含有更多的血液。

总的来说，在研究的发育时期(4.5-9 PCW)内，空间基因表达在胚胎发育的早期就建立并贯穿整个胚胎发育过程，而且心脏区域之间的基因表达差异比不同时期之间的差异更明显。

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2. 6.5-7 PCW人类胚胎的心脏的单细胞基因表达分析

通过10X Genomics Chromium工作站对数据进行处理，生成了3717个单细胞的转录表达谱，每个细胞平均 含有2900个基因和11000条的转录本。为了验证做scRNA-seq分析的6.5 PCW心脏样本可以作为是ST分析的6.5 PCW心脏的生物学复制，作者对两个样本的基因表达的进行了比较，相关性高达0.93，证明作为生物学重复是合理的。作者在两个6.5 PCW的样本中鉴定了18046个相同的基因，而2027个基因仅在scRNA-seq样本中表达，而1174个基因仅在ST样本中表达。大多数仅在ST样本中检测到的基因为Y染色体相关基因(如TTTY14、TTTY15、ZFY)，这是不同性别表征的结果。此外，在分析仅在scRNA-seq样本中发现的基因时，我们观察到了与免疫应答相关的基因(如FCGR2B，IL6)和细胞增殖和凋亡相关的基因(IL1B)，这些基因是在制备单细胞文库之前的组织解离过程中被激活的。

最终，通过对ST和scRNA-seq两个单细胞部分的基因表达谱进行了降维和聚类，鉴定出15个细胞簇，并根据Marker基因的表达情况将其分类为不同的细胞类型。除了心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等已知的心肌细胞类型外，还检测了三种心肌细胞，心脏神经嵴细胞&Schwann祖细胞、心外膜细胞、EPDCs、两种内皮细胞和四种成纤维细胞样细胞。有的细胞簇仅在上半部分心脏组织中检测到，证明心脏上半部含有更丰富的细胞多样性。

3. 绘制心脏发育过程中的细胞基因表达图

为了进一步阐明人类胚胎心脏中存在的不同细胞类型的空间分布及其空间域的异质性，利用原位测序ISS的亚细胞空间分辨率，将其应用于ST分析的三个心脏组织，完成单细胞分辨率的基因表达的时空分析验证。同时用单分子RNA荧光原位杂交(smFISH)进行了验证，结果与ISS相似。在6.5-7PCW心脏的细胞类型中，ISS分析显示了清晰的空间基因表达模式，与ST和scRNA-seq结果一致。

 4. 相似细胞类型的空间分布分析

值得关注的是，通过进一步分析各个簇中相似细胞类型在心脏发育过程中的空间分布，在簇14中确定的两个细胞类型亚群:表达ISL1和STMN2的心脏神经嵴细胞和表达ALDH1A1的Schwann祖细胞。这两种细胞类型均存在于纵膈间充质和OFT中，而在AV心外膜下间质中也检测到Schwann祖细胞。通过分析三个发育阶段OFT中这些基因的ISS结果，发现心脏神经嵴细胞仅在早期出现，而Schwann祖细胞仅在后期出现。房室心外膜下间质在任何时间点都不存在心脏神经嵴细胞，但在后期，Schwann祖细胞在该区域聚集。

该研究发现了三种类型的心肌细胞，它们在所有研究的发育阶段都被检测到。其中两种表达心房和心室的特异性标记物的心肌细胞与其空间定位是一致的。第三种表达MYOZ2和FABP3的心肌细胞也是定位于心房和心室，在之前的人类心脏发育研究中没有报道过。作者将这一新发现的心肌细胞群体命名为Myoz2富集心肌细胞。同时，通过仔细观察两种内皮细胞类型(0簇和10簇)，发现前者(标注为毛细血管内皮)主要分布在小梁心肌，这里的血液主要通过较小的血管(主要是毛细血管)供应。相反，后一种类型(注释为内皮细胞/周细胞/前膜)主要分布于致密的心肌，在这里冠状动脉向心脏供应氧合血。总的来说，这些发现证明了空间基因表达分析在区分相似细胞类型的定位和功能方面的发挥了关键作用。

总之，通过ST技术的探索能力识别三个发育阶段共有的空间全基因组表达模式，利用scRNA-seq技术可以消除发育中期细胞类型的异质性。这两项技术的结合，重现人类心脏发育的整体复杂性。最后，ISS的目标分辨率使我们能够创建一个跨越三个发育阶段的精细亚细胞基因表达图谱。通过空间转录组测序（ST）、单细胞测序（scRNA-seq）、和原位测序（ISS）、smFISH等技术的综合运用，作者建立了一种分子方法，生成了清晰的人类心脏发育过程的细胞图谱。从细胞水平上阐明人类心脏在不同发育时期的时空基因表达模式，对心脏的深入研究具有重要意义。