【文献解读】单细胞转录组揭示B细胞在非小细胞肺癌中的多样性

非小细胞肺癌（NSCLC）是世界上主要的危及生命的癌症。随着手术、放疗、化疗及免疫治疗等的进步，NSCLC的预后已经明显改善，但晚期NSCLC的临床疗效仍不佳。T细胞和B细胞是最丰富的淋巴细胞群，在实体瘤的肿瘤微环境（TME）中起着关键作用。肿瘤浸润性B细胞是TME中一群重要的的免疫细胞。但是，非小细胞肺癌肿瘤微环境中B细胞的亚型、作用机制以及与癌细胞或其它细胞相互作用的方式仍不清楚。因此，全面研究NSCLC的免疫系统，包括免疫细胞亚型（尤其是B细胞）的分布和作用，对于理解非反应性机制以及发现新的生物标志物和治疗策略是必要的。

B细胞通过产生抗体和诱导T细胞活化以及抗原提呈来调控免疫反应。激活B细胞也可以增加T细胞介导的抗癌作用，并通过产生IgM、IgM、IgG2b降解肿瘤细胞。近年来的研究主要集中在T细胞或基质细胞，而对B细胞不同亚型及其功能的研究较少。作者利用单细胞RNA-seq等技术，系统的研究了肿瘤浸润性B细胞与NSCLC患者临床效果之间的关系，并确定了2种B细胞亚型在NSCLC中的作用机制。

1. 材料：非小细胞肺癌患者的肿瘤组织、A549细胞、NCI-H1299细胞

2. 方法：scRNA-seq、流式细胞术、组织学、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)、WB

1.非小细胞肺癌的免疫细胞浸润

对115545个单细胞进行scRNA-seq（图1a），基于细胞特异性标记基因，聚类分析（UMAP）将其分为22个不同的细胞簇，包括T细胞、B细胞、单核细胞、肿瘤细胞和表皮细胞的亚型（图1b）。其中，B细胞包括2个细胞簇（C4，C6）（图1c）。作者也检测了22种细胞簇在11位患者中的分布，发现不同患者的细胞类型组成存在较大的差异（图1d）。

为了确定这些细胞类型在非小细胞肺癌（NSCLC）中的临床效应，作者通过ROC分析选取了决定每种细胞类型的前20个基因。通过TCGA数据的多变量Cox回归分析进一步计算这些基因的表达水平与NSCLC预后之间的相关性。结果表明，高表达的基因（如MS4A1）主要集中在C4中，表明C4在NSCLC肿瘤微环境中具有抗癌作用（图1e，f）。因此，作者又研究了非小细胞肺癌TME中B细胞的亚型及其生物学特性。

2.非小细胞肺癌中多种B细胞亚型共存

为了进一步了解B细胞在NSCLC中的作用，作者又将正常PBMCs的scRNA-seq数据以及NSCLC中B细胞（C4和C6）的scRNA-seq数据进行了合并分析（图2a）。聚类分析将其分为2组，分别为BC1和BC2（图2b）。BC1表达初始B细胞的标记基因（如CD20/MS4A1），BC2表达浆细胞的标记基因（如BCMA）（图2c，2d）。此外，不同时期NSCLC中2种B细胞亚型的分布存在差异，stage III的初始B细胞显著低于stage I（图2e）。通过细胞-细胞相互作用分析，确定了这两种细胞（以及其他细胞类型）之间的细胞-细胞相互作用网络，发现B细胞与其他免疫细胞类型具有很强的相互作用，表明B细胞在NSCLC的微环境中发挥重要作用。

3.初始B细胞与NSCLC良好预后相关

为了确定NSCLC微环境中不同B细胞是否共存以及各细胞亚型的临床相关性，作者利用免疫组织化学和免疫荧光技术对原发NSCLC组织中的CD79A和CD20进行了测定。结果表明，一部分细胞表达CD79A和CD20，而其余细胞仅表达CD79A（图3a）；CD20+细胞主要位于肺癌组织的三级淋巴结构（TLS），而CD79A+细胞同时位于TLS和肿瘤区域，表明CD20+初始B细胞和浆细胞在肺癌中可能发挥多种作用（图3b）。作者利用流失细胞仪分析了30例新鲜NSCLC肿瘤组织（10例stage I、10例stage II和10例stage III），结果也表明这两种B细胞亚型共存（图3c）。此外，CD20+ CD79+B细胞在晚期NSCLC中减少（图3d）。

为了验证这一结果，作者利用CD20和CD79A的抗体对164份NSCLC样品进行染色，利用TILs中CD20+ CD79A+阳性细胞的比值来评估初始B细胞的浸润水平，结果表明stage II和stage III初始B细胞的浸润水平显著低于stage I（图3e）。根据肿瘤组织中CD20+ CD79A+ B细胞的浸润水平，164份NSCLC样品被分为2组，分别为初始B细胞-高组合初始B细胞-低组，两组的预后结果表明：初始B细胞的浸润水平越高，存活率和无复发率越高（图3f）。

4.初始B细胞抑制NSCLC增殖

为了评估初始B细胞对肿瘤细胞的影响，作者利用CD20抗体进行流式细胞术分选获得8例新鲜NSCLC肿瘤组织（4例stage I和4例 stage III）中的初始B细胞，并将其与肺癌细胞系A549和H1299进行体外共培养，培养24h后检测细胞存活率，发现A549和H1299细胞的生长明显受到抑制（图4a，图5a）。

由于免疫细胞对恶性细胞的作用可以通过细胞间的相互作用或通过可溶性介质来实现，因此，作者利用从NSCLC组织分离出的 CD20+ B细胞培养上清处理A549和H1299细胞24h后，发现A549和H1299细胞的生长也受到了抑制，表明CD20+ B细胞对肺癌细胞的作用可以不依赖于细胞间的相互作用，同时也表明CD20+ B细胞分泌的蛋白可能参与了CD20+ B细胞在非小细胞肺癌中的抗癌作用（图4b，图5b）。

为了进一步确定B细胞分泌的哪些因子参与了肿瘤细胞的调控，作者分析了CD20+ B细胞中高表达的基因，共鉴定到1426个高表达的基因以及66个特异表达的基因，并进行了蛋白注释，有4个分泌蛋白（VNN2、IFI30、PIK3AP1、SERPINA9）在CD20+ B细胞中特异表达（图4c）。为了验证这一结果，作者测定了B细胞培养基中的SERPINA9和VNN2的蛋白含量，发现SERPINA9和VNN2被富集，表明非小细胞肺癌中CD20+ B细胞能够分泌这些蛋白（图4d）。作者又在A549和H1299细胞中过表达了这些基因，发现SERPINA9和VNN2抑制了A549和H1299细胞的生长（图4e，图5c）。

图4 初始B细胞抑制肺癌细胞生长

5.晚期NSCLC中浆细胞促进肿瘤细胞增殖，早期NSCLC中浆细胞部分抑制肿瘤细胞增殖

为了进一步确定浆细胞在NSCLC肿瘤进展中的作用，作者从3个 stage I肿瘤组织和3个 stage III肿瘤组织中分离出浆细胞，并将其与肺癌细胞系A549和H1299进行体外共培养，发现stage III的浆细胞促进A549和H1299细胞的增殖，而stage I的浆细胞抑制A549和H1299细胞的增殖，表明浆细胞在stage III NSCLC中具有促肿瘤作用，而在stage I NSCLC中具有抑癌作用（图6a，图7a）。

为了确认这些浆细胞的作用是通过细胞间的相互作用还是通过分泌分子发挥作用，作者利用从stage I或stage III NSCLC中分离出的浆细胞培养上清处理A549和H1299细胞，发现stage III的浆细胞培养上清促进A549和H1299细胞的增殖，而stage I的浆细胞培养上清抑制A549和H1299细胞的增殖，表明浆细胞也可通过分泌分子起作用（图6b，图7b）。

scRNA-seq的结果显示：在浆细胞中，IGHG1和IGHG4基因（编码IgG蛋白）表达量较高（图2d）。因此，作者研究了浆细胞培养液中IgG和IgA的表达，发现IgG表达水平较高（图6c）。为了确定IgG的作用，作者从不同阶段的NSCLC中分离出IgG（图6d），并用这些IgG处理A549，发现从stage I NSCLC中分离到的IgG对A549细胞有轻微的毒性作用，而从stage III NSCLC中分离到的IgG显著加速了A549细胞的生长，表明在不同阶段NSCLC分泌的IgG能够影响浆细胞对肿瘤细胞的作用（图6e）。

 图6 不同阶段肺癌的浆细胞产生的IgG对肿瘤细胞具有不同的作用

图7 浆细胞对H1299的作用

6.病理免疫球蛋白靶点的鉴定

为了阐明浆细胞产生的IgGs的作用，作者进一步确定了IgGs在癌细胞中的作用靶点。利用免疫沉淀和质谱分析，鉴定到了637个蛋白（图8a）。这些蛋白可以分为3组：IgG蛋白、IgG结合蛋白（主要为Fc结合蛋白）、IgGs靶点（图8b）。IgGs在肺癌中的许多新靶点都是非细胞表面蛋白，并且是接头蛋白，如AP-2复合物（包括AP2A1、AP2A2、AP2B1、AP2S1、AP2M1等）（图8b）。据报道，AP-2复合物主要参与内吞作用，因此，作者推测病理IgGs可能通过AP-2复合物被内吞到其他细胞中。为了验证这一假设，作者首先测定了肺癌微环境中AP-2的表达，结果显示AP-2蛋白在肿瘤细胞和肺癌单核细胞中均有较高表达。其次，在A549细胞中过表达AP2A1A（AP2复合物的核心成分），并将纯化后的人IgGs加入到细胞培养液中，发现在AP2A1过表达的细胞中，IgGs显著增加，表明IgGs将以依赖于AP-2的方式进入肿瘤细胞（图8e）。

为了阐明进入肿瘤细胞的IgGs的潜在功能，作者又研究了鉴定到的IgG结合蛋白，结合前人的研究，发现IgGs可能通过与肿瘤细胞中的TRIM21的关联，促进了特异性靶点的降解（图8b）。Rhocs是质谱鉴定得到的IgGs靶点之一，是NSCLC细胞中高表达的癌基因，参与肿瘤细胞的增殖和转移。作者把病理的Rhoc IgGs和Rhoc缺失的IgGs通过电穿孔的方式分别导入A549和H1299细胞。Rhoc IgGs处理后，Rhoc的表达显著降低（图8f），表明Rhoc IgGs可能触发TRIM21通路，导致Rhoc蛋白降解。这些结果表明IgGs在肿瘤细胞中的新的作用，即在AP2复合物的帮助下，IgGs可被导入肿瘤细胞，导入的IgGs通过Fab区与靶点结合，通过Fc区与TRIM21作用，最终导致肿瘤细胞中RHOC的降解（图8h）。

初始B细胞在晚期NSCLC中减少，与不良预后相关。初始B细胞通过分泌4种因子负向调节细胞生长，从而抑制肺癌细胞的生长。浆细胞在早期NSCLC中抑制肿瘤细胞增殖，晚期NSCLC中促进肿瘤细胞增殖。蛋白组学分析验证了浆细胞产生的免疫球蛋白及其相互作用的蛋白在NSCLC进展中的作用。作者的研究对B细胞亚型和免疫球蛋白在调节非小细胞肺癌进展中的作用提供了新的见解。单细胞转录组和蛋白组学分析为以后研究NSCLC中B细胞和其他免疫细胞提供了重要资源，对临床实践也具有参考意义。

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