​单细胞RNA-seq揭开了先天性纤维化肺部中异位和畸变常驻细胞群的神秘面纱

作者等人对来自32个IPF（45个文库，147,169个细胞），18个慢性阻塞性肺疾病(COPD)（24个文库，69,456个细胞），28个对照（38个文库，96,303个细胞）的肺远端实质标本的312,928个细胞进行了单细胞测序分析（图1A），获得38个细胞类群（图1B），分为四大类（图1B&1C）

图1.  A. 实验设计流程图

       B. UMAP将312.928个细胞分为38个类群

       C. 38种细胞类型标记基因的热图，分为四大类细胞

1. 纤维化肺上皮细胞发生明显改变，并含有异常的基底细胞

在非病变组织中，作者确定了所有已知的肺上皮细胞群（图2A），IPF肺上皮细胞库的特征是气管上皮细胞比例增加和肺泡上皮细胞显著减少，IPF的RNA-seq数据也证实起源于肺远端肺泡上皮细胞的基因减少（图2B），令人印象深刻的是，与对照组或COPD相比，几乎作者鉴定的每一种上皮细胞类型在IPF肺中都表现出了基因表达的变化（图2C）。

在上皮细胞中，作者确定了一种细胞群，它在转录上不同于以前在肺中描述的任何上皮细胞类型，称之为异常基底细胞（图2D），除了上皮标志物外，这些细胞还表达基底细胞标志物TP63、KRT17、LAMB3和LAMC2，但不表达其他已建立的基底细胞标志物，如KRT5和KRT15。这些细胞表达上皮-间质转化标记物，如VIM、CDH2、FN1、COL1A1、TNC和HMGA2，表达衰老相关基因包括CDKN1A、CDKN2A、CCND1、CCND2、 MDM2和 GDF15，以及在已分析IPF相关的所有细胞类型中表达水平最高的分子标记物：如,基质金属肽酶7，与αvβ6亚单位，EPHB2。通过对转录因子富集情况进行评估，这些细胞表现出很高的表达水平，并激活了下游对远端气管发育和修复至关重要的转录因子 SOX9 。对照组肺组织未见异常的基底细胞。作者等人又采用免疫组化法（IHC）以p63，KRT17，HMGA2COX2和p21作为标记物，在IPF肺组织中以确认了这些细胞的存在并进行了定位。

图2.   A. UMAP将21,184个上皮细胞分类图

B. 所有样本上皮细胞在每个疾病组中所占的比例

C. Bulk RNAseq 和 scRNAseq Data 对比图

D. IPF肺异常基底细胞IHC染色:覆盖成纤维细胞灶的上皮细胞为p63⁺ KRT17⁺

嗜碱性细胞染色COX2^-， p21^-和hmga2阳性，而支气管基底细胞没有

IPF中，血管内皮细胞的变化早已被发现，但对它们的细胞和分子特性却知之甚少。血管内皮(VE)细胞的聚类分析很容易可以得到四种细胞类型：毛细血管型、动脉型或静脉型VE细胞等。第五种VE细胞则需要通过COL15A1的表达来区分，通过对人类蛋白质图谱中获得的COL15A1在健康肺组织中的免疫组化分析来看，COL15A1阳性的VE细胞仅分布在主气管附近的血管系统，因此作者称这些细胞为支气管周围细胞(pVE)。尽管pVE细胞在所有疾病状态的受试者中都被发现，但与对照组或COPD相比，它们在IPF样本中的比例要高得多。使用泛内皮标记物CD31和COL15A1定位pVE细胞证实，在对照组肺内，它们仅分布在近端大气道周围的支气管血管系统，但是IPF肺内，在支气管扩张区域和纤维化区域大量可见COL15A1⁺ CD31⁺的VE细胞（图3A），

对最近发表的包含正常气管和肺实质样本的scRNA-seq数据集的再分析证实在远端肺VE中未观察到pVE特异性基因（图3B）总的来说，这些观察结果表明，在IPF中COL15A1⁺VE细胞代表肺远端异位的pVE群

图3.  A. 对照远端肺、近端肺，IPF远端肺CD31 (PECAM1)和COL15A1的免疫组化染色

B. pan-VE标记和pVE特异性标记在远端VE细胞和气道肺样本中的表达小提琴图

3. IPF肺在成纤维细胞和肌成纤维细胞中表现出疾病相关的原型

为了表征IPF肺中的肌成纤维细胞和成纤维细胞，作者首先关注以PDGFRB表达为特征的细胞群，去除以平滑肌细胞(DES、ACTG2和PLN)或周细胞(RGS5和COX4I2)为特征的细胞。该策略能够识别两种基质细胞群:以CD34、FBN1、FBLN2和VIT的表达为特征的成纤维细胞和持续表达MYLK、NEBL、MYO10、MYO1D、 RYR2和ITGA8的肌成纤维细胞，正如小鼠肺中描述的那样。

这些特征在IPF和对照组肺的两个细胞群中是一致的。IPF肺含有富含纤维胶原和ACTA2的肌成纤维细胞表型，以及HAS1、 HAS2、 FBN1、及SHH诱导的趋化因子CXCL14表达明显增加的成纤维细胞表型，应用谱系重建技术(PAGA)对两种细胞类型的亚聚类群体(图4A)显示，成纤维细胞和肌成纤维细胞之间表型空间中连接结构的可能性相对较弱。每个细胞类型内的非监督拟时序分析显示在IPF肺的每个气管远端存在细胞的富集。这些原型的交叉学科IPF富集分析表明，在肌成纤维细胞中具有高水平的显著性，但在成纤维细胞中只有边际显著性水平。扩散伪时间(DPT)距离和基因表达之间的Spearman相关性分析显示，在IPF每个气管的边缘，逐渐或者逐步增加的基因表达情况通常与活化的肌成纤维细胞(图4D)或侵袭性成纤维细胞(图4E)有关。总之，这些结果表明，IPF与成纤维细胞和肌成纤维细胞同时发生，但不一定是交叉的。

图4. A. 来自32例IPF，18例COPD，26例对照组的6166个细胞的UMAP分析（上）及PAGA分析（下）  

      B. 肌成纤维细胞和成纤维细胞的热图

4. 原纤维性巨噬细胞原型掩盖了IPF肺免疫

   作者鉴定了18种不同种类的免疫细胞，这些细胞来自于不同疾病条件下的多个受试者的样本。与对照组相比，IPF中朗格汉斯树突状细胞和调节性T细胞比例升高（分别是2.3-和1.9-倍）。为了进一步阐述这些细胞的特征，作者采用三元模式对经典单核细胞、促纤维化IPF巨噬细胞原型和炎症巨噬细胞原型进行分析。在接近其最极端的末端时，IPF巨噬细胞原型相关特征会逐渐而连续地发生变化，SPP1、胆固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶和LIPA沿轨迹表达量稳步升高，ECM重构基因SPARC、GPC4、PALLD、CTSK和MMP9的表达沿气管进一步升高。在IPF原型的末端，巨噬细胞开始表达CSF1，表明可能存在新生或激活的自分泌反馈环。

5. IPF肺基因调控网络明显偏离对照组

为了更好地了解IPF肺的调控网络是如何改变，作者将bigSCale基因调控网络(GRN)推理方法应用于对照细胞和IPF细胞（图5A），IPF的 GRN拓扑结构密度与对照组的GRN比较，相对较高，这反映在基因-基因关系和模块上，也反映在类群内的联系多于类群间的联系（图5B），对照组GRN在类群内部和类群之间显示了相对多样化的细胞，且与非纤维化肺的器官功能一致。在IPF GRN中，主要的上皮相关类群与网络的其他部分保持很大程度的分离，其中密度最高的类群主要由异常的基底细胞驱动。

图5.   A. bigSCale基因调控网络(GRN)推理方法流程图

        B. 对照组和IPF的网络结构 GRNs概述图

        C. 对照组和IPF肺细胞的GRNs

在这项研究中，作者提供了IPF肺的单细胞图谱，聚焦于异常上皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞群。提供了IPF中纤维细胞的全面描述，其中，异常的基底细胞与肌成纤维细胞病灶交界，在原纤维性单核细胞来源巨噬细胞存在的情况下，形成由异位支气管血管浸润的病变。对IPF肺中异常细胞群的鉴别和详细描述，可能会使人们对细胞类型特异性的治疗方法和生物标志物产生新的认知。作者的IPF细胞图谱为探索肺健康和疾病中基因表达的细胞特异性变化提供了一个可互动交流的资源平台，从而加快了疾病的研究和治疗进程。

文：荒慌

排版：市场部

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