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引言

酶在医药领域中的用途非常广泛，但其不稳定性对于实际的药用效果具有直接影响，此外保持酶活性的方法也尚未发展成熟，因此如何保持酶的活性、稳定性成为了研究热点之一。针对以上问题，来自意大利摩德纳·雷焦·艾米利亚大学、博洛尼亚大学以及美国普林斯顿大学的研究团队联合在 Nanomaterials 发表了文章，实验比较了含有 Tween^®20、60 或 80 的 β-葡萄糖苷酶 (β-Glu) 溶液负载的聚乳酸-共乙醇酸 (Poly (lactic-co-glycolic) Acid, PLGA) 纳米颗粒 (Nanoparticles, NPs)，并深入研究了不同摩尔比例 Tween^®20: β-Glu 混合溶液的特性。研究结果表明：将酶与 Tween^® 混合不会对 PLGA NPs 的大小和物理特性产生影响，并且 Tween^®20:β-Glu 的摩尔比例与酶的活性正相关。

研究材料与方法

实验过程中采用的材料包括：聚乳酸-共乙醇酸 (PLGA)，β-葡萄糖苷酶 (β-Glu)，Tween^®20、60、80，聚乙烯醇 (Poly (vinyl alcohol), PVA)，牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin, BSA) 以及超纯水等。实验利用 Tween^® 溶解 5 mg 的 β-Glu，再使用超纯水将其稀释至 500 μL，制备形成 β-Glu 混合物，Tween^®:β-Glu 的摩尔比保持在 2248:1。文章详细介绍了在 PLGA 包封 BSA 的过程，以及采用双乳液法制备 PLGA NPs 的方法。在分析阶段，作者团队利用等温滴定量热法微量量热计 (Malvern Panalytical) 检测了不同摩尔比例 (从 60:1 到 2419:1) Tween^®20:β-Glu 溶液的特点，并通过光子相关光谱 (Photon Correlation Spectroscopy, PCS)、原子力显微镜 (Atomic Force Microscopy, AFM) 和扫描电子显微镜场发射枪 (Scanning Electron Microscopy Field Emission Gun, SEM-FEG) 表征分析溶液混合物配制形成的聚合物 NPs 的尺寸和剪切面电位，此外还测量了 PLGA NPs 中 Tween^®20 和 β-Glu 的数量及其对酶活性的影响，分析了不同稳定剂组合的效果。

研究结果

Tween^® 是一种有助于形成 NPs 和保持酶稳定性的表面活性剂。研究比较了 β-Glu 混合不同 Tween^® 系列产生的表面活性剂特性，其中 Tween^® 分别利用月桂酸 (Tween^®20)、硬脂酸 (Tween^®60) 或单油酸 (Tween^®80) 酯化。研究结果表明：不同的 Tween^® 表面活性剂几乎不影响 NPs 的自组装过程和产率，而与只采用 β-Glu 样本中的 NPs 相比，三种 Tween^®:β-Glu 中的 NPs 产量略有提高，其中含有 Tween^®20 表面活性剂中的 NPs 产量最显著；此外含有 Tween^®20 表面活性剂中的 NPs 的活性保持效果最佳 (图 1)。

图 1. β-Glu 与 Tween^® 20、60、80，混合并包封成 PLGA NPs 后的活性表征结果

实验针对 Tween^®20 进行了更深入的研究，具体内容包括：根据 Tween^®20:β-Glu 摩尔比例的差异，将实验样本分成 4 组实验组和 1 组对照组 (不含 Tween^®20)，实验组中 Tween^®:β-Glu 的摩尔比例为 60:1~2419:1，并且所有混合物的总体积和酶含量分别保持在 500 μL 和 5 mg 不变。研究还利用等温滴定量热法对所有溶液混合物的酶稳定作用进行分析，其结果表明酶稳定作用主要来源于 NPs 配方期间产生的影响，并且剪切面电位误差等检测数据也证明了该结论的可靠性 (图 2)。

图 2. 等温滴定量热法分析 Tween^®20 和 β-Glu 的结果：(A) 在 PBS 缓冲液中利用 β-Glu (37 µM) 滴定 Tween^®20 (0.5 Mm, PH=6) 的原始数据；(B) Tween^®20 滴定过程中 β-Glu 的结合等温线结果

研究还利用 AFM 和 SEM-FEG 分析了 NPs 的形态和自组装情况 (图 3)。AFM 结果显示：所有 Tween^®20:酶溶液都被包封在 NPs 中，其尺寸范围为 150~300 nm，部分团聚物尺寸达到 500 nm；随着 Tween^®20 摩尔比例的增加，形成了更均匀的球形 NPs。SEM-FEG 分析结果也验证了 AFM 的表征结论。此外，活性检测结果表明：不同混合物之间的差异不显著，但整体随着 Tween^®20:β-Glu 摩尔比例的增高活性逐渐增大。

图 3. 不同摩尔比 Tween^®20:β-Glu 被封装到 PLGA NPs 中的活性比较

实验还研究了从 NPs 释放的 β-Glu 含量和活性，其结果表明：释放的 β-Glu 具有一定的稳定性；相对于单独封装的 NPs，含有 Tween^®20:β-Glu 的 NPs 释放的酶具有更高的稳定性，能够保持更高水平和更长的时间的活性。研究还比较了包封了 BSA:β-Glu (摩尔比例20:1)、不同摩尔比例 Tween^®20:β-Glu 混合溶液中 NPs 的活性，分析了不同稳定剂组合的效果，其结果表明：不同稳定剂组合与单独稳定剂中的 NPs 相比具有更高的活性。

总结讨论

不同的稳定剂组合对于医药领域中酶的稳定性和活性具有显著影响。实验通过比较含有 Tween^®20、60 或 80 的 β-葡萄糖苷酶 (β-Glu) 溶液负载的聚乳酸-共乙醇酸 (PLGA) 纳米颗粒 (NPs)，其结果显示：Tween^®20 与 β-Glu 混合形成 PLGA NPs 具有较好的稳定性；基于以上实验基础，作者团队还采用等温滴定量热法分析了不同摩尔比例 (从 60:1 到 2419:1) Tween^®20:酶溶液的特点，通过原子力显微镜 (AFM) 和扫描电子显微镜场发射枪 (SEM-FEG) 表征分析溶液混合物配制形成的聚合物 NPs，测量了 PLGA NPs 中 Tween^®20 和 β-Glu 的数量及其对酶活性的影响，此外还分析了不同稳定剂组合的效果。研究结果为高效率含酶 NPs 的设计与制备提供了参考。

原文出自 Nanomaterials 期刊

Duskey, J.T.; Ottonelli, I.; Rinaldi, A.; Parmeggiani, I.; Zambelli, B.; Wang, L.Z.; Prud’homme, R.K.; Vandelli, M.A.; Tosi, G.; Ruozi, B. Tween^® Preserves Enzyme Activity and Stability in PLGA Nanoparticles. Nanomaterials 2021, 11, 2946.

   Nanomaterials 期刊介绍

主编：

Shirley Chiang, University of California Davis, USA

期刊主题涵盖纳米材料 (纳米粒子、薄膜、涂层、有机/无机纳米复合材料、量子点、石墨烯、碳纳米管等)、纳米技术 (合成、表征、模拟等) 以及纳米材料在各个领域的应用 (生物医药、能源、环境、电子信息等) 等。

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特约撰稿人

赖寿强  博士研究生

厦门大学

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