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引言

心血管疾病的发病率及其造成的死亡比例非常高，并且具有血压、血液胆固醇和葡萄糖水平升高以及诱发性肥胖等明显的伴随症状。初期诊断作为该疾病的有效应对手段，其相关的策略得到了医学界的广泛关注。来自德国柏林工业大学的 Zeynep Altintas 教授团队在 Nanomaterials 发表了文章，研究采用石墨烯量子点 (Graphene Quantum Dots, GQDs) 和金纳米颗粒 (Gold Nanoparticles, AuNPs) 修饰的用于超灵敏无酶电化学纳米免疫传感器的丝网印刷金电极 (Screen-Printed Gold Electrode, SPGE)，该传感器可用于心肌梗死 (Acute Myocardial Infarction, AMI) 的早期诊断。研究还采用方波伏安法 (Square-Wave Voltammetry, SWV)、循环伏安法 (Cyclic Voltammetry, CV)、电子阻抗谱 (Electron Impedance Spectroscopy, EIS) 和原子力显微镜 (Atomic Force Microscopy, AFM) 测试分析了传感器制造过程中的特性变化，并利用透射电镜 (Transmission Electron Microscopy, TEM) 和扫描电镜 (Scanning Electron Microscopy, SEM) 对 AuNPs、GQDs 及其纳米复合材料进行了表征。

图 1. 具有 AuNPs 和 GQDs 丝网印刷金电极 (SPGE) 的新型电化学纳米免疫传感器制造步骤。

研究材料与方法

为了更便捷的测定 cTnI 生物标志物，作者团队设计了纳米复合材料修饰的无酶电化学纳米免疫传感器 (图 1)。实验首先研究了优化纳米复合材料和用于安培分析的 H₂O₂ 浓度、纳米复合材料在 SPGE 表面的植入策略，以及抗 cTnI (cTnI-抗体) 浓度等多个参数，并且测量和比较了裸 SPGE 和纳米复合材料功能化 SPGE 所提供的安培响应。研究还利用 SEM 和 TEM 对 AuNPs、GQDs 及其纳米复合材料进行了分析。AuNPs 和 GQDs 分别被用作纳米酶和信号放大剂，以取代酶系统以及提高设计的抗体传感器的灵敏度，为了研究其信号—浓度关系，还利用安培法在纳米复合材料涂层的 SPGE 表面进行 200 秒的测量，并对 H₂O₂ 浓度进行了优化，研究了 H₂O₂ 孵育时间的影响；将纳米复合材料滴涂在 SPGE 表面后，通过 EDC-NHS 耦合化学活化 GQDs 的官能团。

研究利用原子力显微镜对 SPGE 的逐步制备进行了表征；抗体固定后，在进行生物标志物检测之前，将 SPGE 与 100µg mL⁻¹ BSA (在双蒸馏水中制备) 孵育 1 分钟，以阻断 SPGE 上的无抗体区域，并避免免疫反应期间可能的非特异性相互作用。此外还通过测试参考生物分子 (包括 NSE、D-(+)-葡萄糖、BSA、转铁蛋白和多巴胺) 可能的交叉反应，研究了所开发的纳米免疫传感器的特异性。研究还在氧化还原标记溶液存在的 SWV 法进行电化学测量，并研究了人血清中 cTnI 的电化学检测，研究结果表明：制备的纳米免疫传感器具有广阔的临床应用潜力。

研究结果

AuNPs 和 GQDs 及其纳米复合材料表征

AuNPs 的 TEM 和 SEM 表征结果表明：其球形纳米颗粒的平均直径为 4.7±2 nm，并且 XRD 结果证明了内部合成的 AuNPs 具有晶体特征。GQDs 的 TEM 表征结果显示：其颗粒的大小约为 8~10 nm，并且尺寸和形貌均匀，EDX 光谱还显示了其元素组成。如图 2 所示，纳米复合材料的 TEM 测试结果显示了其均匀的尺寸分布；其 SEM 研究结果显示，AuNPs 以黑色颗粒状颗粒的形式出现，大小分布均匀，而 GQDs 以岛状形式出现；EDX 结果还显示了纳米复合材料混合物中由于前驱体导致的无机盐存在。

图 2. AuNPs@GQDs 在 (A) 20 nm 和 (B) 5 nm 尺度的 TEM 图像；AuNPs@GQDs/SPGE在 (C) 1 μm 和 (D) 100 nm 尺度的 SEM 图像；GQDs@AuNPs/ 硅片在 (E) 1 μm和 (F) 100 nm 尺度的 SEM 图像；(G) AuNPs@GQDs 的 EDX 光谱。

最佳纳米复合材料和 H₂O₂ 浓度的测定

本文分别将 GQDs 和 AuNPs 作为纳米酶和信号放大剂，以取代酶系统并提高纳米免疫传感器的灵敏度。作者团队分别将两种不同浓度的 GQDs 和 AuNPs 结合并进行测试，以获取其信号—浓度关系；此外还使用了三种不同浓度的 H₂O₂ (2.5 mM、5.0 mM 和 10 mM) 对上述纳米复合材料浓度的所有可能组合进行了安培测量。为了研究在 SPGE 表面添加 10 mM H₂O₂ 后安培测量时间的重要性，研究还进行了下一步的实验。在表面用 H₂O₂ 对优化浓度的纳米复合材料孵育 5 分钟后进行安培测量，并在裸 SPGE 表面上进行了安培分析。

SPGE 上植入 AuNPs@GQDs 的方法及抗体固定化

研究还对比了三种纳米复合材料植入 SPGE 的策略，包括：利用多步安培法实现 AuNPs@GQDs 电沉积、在多巴胺存在下利用多步安培法实现 AuNPs@GQDs 电沉积、在室温下对 AuNPs@GQDs 进行滴涂。通过对比研究，最终采用了滴涂方法来制造传感器以及进行生物检测。研究了还对比了三种不同浓度的 cTnI 抗体 (10 µg mL⁻¹、25 µg mL⁻¹ 和 50 µg mL⁻¹) 用作生物测定的效果，其结果表明 25 µg mL⁻¹ 为最佳抗体浓度。

传感器制造与表征

研究详细介绍了 AuNPs@GQDs 电化学免疫传感器的制造过程，具体流程如图 1 所示。实验过程中采用了 SWV 和 EIS 技术对每个传感器制造步骤进行表征 (图 3)，包括 SPGE 的等离子清洗、AuNPs@GQDs 在 SPGE 上的滴涂、AuNPs@GQDs/SPGE 上的抗体固定，以及孵育 10 分钟后将 cTnI 结合到抗体/AuNPs@GQDs/SPGE 表面等。如图 3 所示，滴镀 AuNPs@GQDs 后 SWV 曲线峰值电流明显增大，说明纳米复合材料成功植入 SPGE 表面。在 SPGE 表面沉积纳米复合材料后，产生的信号放大是由于表面积的增加，这将为抗体固定提供一个大的自由空间。随后，在 AuNPs@GQDs/SPGE 表面孵育抗体后，传感器信号明显下降，证实抗体成功固定在 AuNPs@GQDs/SPGE 表面。将 100 pg mL⁻¹ cTnI 结合到抗体/AuNPs@GQDs/SPGE 表面后，SWV 峰值进一步降低，表明通过免疫反应存在 cTnI 抗原。此外，在 CV 的情况下也观察到类似的趋势。

图 3. 电化学免疫传感器的制造过程中的方波伏安、信号响应 EIS 以及 AFM 表征结果。

研究还采用 SWV、CV、EIS 和安培法对 cTnI 进行了测定，并采用研发的电化学抗体传感器，针对以 cTnI 为目标分析物的人转铁蛋白、NSE、多巴胺、BSA 和葡萄糖等非特异性分子进行研究。此外，为了实现设计的 AuNPs@GQDs 电化学免疫传感器的临床适用性，还研究了其在人血清中的性能，其中使用 SWV、CV 和安培法在 10 至 1000 pg mL⁻¹ 的线性浓度范围内测定了 cTnI。

总结讨论

研究开发了一种基于 AuNPs 和 GQDs 的新型电化学纳米免疫传感器，该传感器可以使用 SWV、CV、EIS 和安培测量等技术，以高灵敏度检测 cTnI 生物标志物。在传感器的制备过程中，作者团队还采用 TEM、SEM、XRD 和 AFM 等方法对 AuNPs、GQDs 及其纳米复合材料的形貌，采用 SWV、CV、EIS 等方法对不同制备步骤的免疫传感器进行了表征。研究结果证明了基于 AuNPs 和 GQDs 的新型电化学纳米免疫传感器在 AMI 现场检测中具有广阔的应用前景。

原文出自 Nanomaterials 期刊

Mansuriya, B.D.; Altintas, Z. Enzyme-Free Electrochemical Nano-Immunosensor Based on Graphene Quantum Dots and Gold Nanoparticles for Cardiac Biomarker Determination. Nanomaterials 2021, 11, 578.

   Nanomaterials 期刊介绍

主编：

Shirley Chiang, University of California Davis, USA

期刊主题涵盖纳米材料 (纳米粒子、薄膜、涂层、有机/无机纳米复合材料、量子点、石墨烯、碳纳米管等)、纳米技术 (合成、表征、模拟等) 以及纳米材料在各个领域的应用 (生物医药、能源、环境、电子信息等) 等。

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特约撰稿人

赖寿强  博士研究生

厦门大学

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