Carbohydrate Polymers | 纤维素纳米晶体与纤维素纳米球：细胞毒性和巨噬细胞极化潜力的比较研究
给定的组织工程方法的成功在很大程度上受到宿主免疫系统的影响。M1（经典激活）和M2（交替激活）是两种广泛报道的巨噬细胞表型，它们的极化受到植入生物材料的物理化学和地形特性的深刻影响。纳米纤维素具有独特的物理化学性质（如表面积和纵横比），并对免疫细胞产生不同的影响。了解生物材料介导的巨噬细胞极化过程将有助于组织工程材料的设计和开发。然而，尽管纳米纤维素的形状和大小显着影响巨噬细胞极化，但形状调节的纳米纤维素对该过程的影响尚未见报道。监测这种高纵横比纳米材料的结晶度、表面形貌和反应性对于高效组织工程至关重要。
基于此，韩国江原国立大学森林科学研究所生物系统工程系Ki-Taek Lim教授研究了形状调节的纳米纤维素（球形和棒状）对体外小鼠巨噬细胞系 RAW 264.7 细胞极化的影响。
图文解读
Structural morphologies of extracted nanocellulose
提取不同纳米纤维素及其诱导巨噬细胞极化的能力的示意图如图1a所示。利用茜素红染色法将纤维素生成纤维素纳米纳米球（s-NC），在此过程中会产生纤维素纳米晶体（CNCs），同时也氧化C6羟基并将其转化为羧基（图1b）。图1c为使用TEM检查提取的CNCs和s-NC的形貌。CNCs表现出典型的针状形态结构，平均长度为140 nm，提取的 s-NC 的直径为 43 nm。酸水解和APS水解纳米纤维素的AFM图像如图1d所示。在CNCs的AFM图像中观察到平均长度为150 nm的典型针状形态，这与TEM结果一致。从AFM图像中清楚地观察到s-NC的形成。
Fig. 1. (a) Schematic representation of the preparation of distinct nanocellulose (NC) samples and their macrophage polarization potential, (b) Proposed pathway for s-NC preparation with APS, (c) TEM images of (i) CNCs, and (ii) s-NC, and (d) AFM images of (i) CNCs, and (ii) s-NC.
Physical Approach
测量zeta电位（ζ）以检查在不同氧化条件下产生的提取纳米纤维素的表面电荷，获得的值如图2a所示。CNC和s-NC的zeta电位分别为-25.9和-36.0 mV，表明其结构中存在带电官能团。采用电导滴定法测定了所制备的纳米纤维素在硫酸盐和羧酸盐含量方面的表面电荷密度，结果如图2b所示。CNC和s-NC的表面电荷分别为0.129和0.185 mmol g−1。图2c为使用ICP测定纳米纤维素上的表面电荷，进一步研究了CNC和s-NC的离子（Ca2+和PO43−）结合电位。作者使用ICP检查了处理介质中残留的离子浓度。与溶液中CNC（40.0±0.16 ppm）组相比，，s-NC处理组的Ca2+离子浓度（39.85±0.14ppm）较低，表明前者带正电荷的Ca2+离子结合增加。CNC的C（1s）的高分辨率XPS光谱如图2d所示。S（2p）的高分辨率XPS光谱如图2e所示。在167.9 eV处观察到一个突出的峰，表明通过酸水解在结构中存在硫酸盐官能团。s-NC的C（1s）的高分辨率XPS光谱如图2f所示。
Fig. 2. (a) Zeta potential of the prepared NC, (b) Surface charge on the prepared nanocellulose, (c) Ion adsorption potential of the prepared NC determined using the ICP method, and (d–f) XPS spectra of the indicated nanocellulose in indicated survey regions.
Cytotoxicity of extracted nanocellulose
使用WST-8测定法评估提取的纳米纤维素在不同浓度（20，40，60，80和100μg/ 100mL）和特定时间间隔下的hBMSCs的细胞毒性，结果如图3a和b所示。使用未用纳米纤维素处理的hBMSC和培养基作为对照。纳米纤维素处理组在处理1 d后表现出比对照组更大的细胞活性。图3c为使用荧光显微镜检查与纳米纤维素孵育3 d后hBMSC的形态特征。使用未用纳米纤维素处理的组作为对照。这些细胞看起来很健康，形状细长，并且相互连接。纳米纤维素处理组的细胞密度高于对照组，表明该材料具有良好的生物相容性。此外，s-NC孵育组的细胞密度高于CNC处理组，表明前者的细胞相容性更好。
Fig. 3. Cytotoxicity evaluation of the NC samples. Cell viability of hBMSCs treated with (a) CNCs, (b) s-NC at varying concentrations and at indicated periods. (c) Inverted fluorescence microscopy images showing hBMSC morphologies resulting from 3 d of treatment with the indicated NC.
Mineralization and ALP potentials of nanocellulose
图4a表示采用ARS方法对制备的纳米纤维素进行hBMSCs孵育7和14 d后的矿化效率评估。使用未用纳米纤维素处理的组作为对照。孵育7 d后，纳米纤维素处理组的矿物结核形成程度高于对照组，显示出其优越的矿化潜力。矿化结核的形成随着潜伏期（14 d）的增加而进一步增加，表明矿化潜力有所提高。还确定了沉积矿物的定量值，结果如图4b所示。处理7和14 d后，纳米纤维素孵育组的矿物沉积量高于对照组，证明了纳米纤维素的矿化增强性能。
Fig. 4. Mineralization potentials of the developed NCs. (a) Optical images of the minerals formed after 7 and 14 d of incubation with the developed NCs, (b) Quantitative values for the formed minerals, and (c) ALP activity observed after treatment with the developed NCs at indicated periods.
Antibody array and bioinformatics study
作者进行了细胞因子抗体阵列C5分析，以评估处理5天后RAW 264.7细胞的巨噬细胞极化能力形状调节的纳米纤维素，结果如图5a所示。未进行纳米纤维素处理的组被视为对照组。与对照相比，纳米纤维素处理的阵列膜显示出更强烈的斑点，证明了其极化潜力。图5b显示了s-NC处理组分泌细胞因子的定量值。在s-NC处理组中，与M1巨噬细胞极化相关的分泌细胞因子的倍数变化更大，表明处理过的纳米纤维素具有更高的M1极化电位。然而，它们的倍数变化低于与M1巨噬细胞极化相关的细胞因子。基于分泌的细胞因子/趋化因子，作者进行了生物信息分析，数据如图5c所示。这些反应与炎症、防御和免疫有关，这是M1极化的特征。这些结果表明，与CNC相比，与s-NC孵育5天后，M1极化主要发生
Fig. 5. (a) The proteomic analysis of the secreted cytokines/chemokines with RAW 264.7 cells in the presence of nanocellulose, (b) The quantitative values of the secreted cytokines/chemokines after 5 days of incubation, and (c) The bioinformatics analysis for the secreted cytokines/chemokines after 5 days of treatment.
总结
作者发现s-NC 表现出比 CNC 更高的 zeta 电位和电荷。用 s-NC 处理比相同浓度的 CNC 处理导致更高的细胞活力，表明 s-NC 具有优异的生物相容性。与 CNC 处理组相比，在 s-NC 处理组中观察到增强的矿化和 ALP 活性，表明前者的成骨潜力。在用提取的纳米纤维素材料处理后，还检查了 RAW 264.7 细胞的巨噬细胞极化，结果表明它受纳米纤维素尺寸的显著影响。CNC 偏向于 M1 极化，而与 s-NC 孵育 24 小时后导致 M2 极化。然而，在用 s-NC 长时间培养（3 天和 5 天）后，观察到 M2 → M1 极化的转换。与每种纳米纤维素材料孵育 36 小时后获得的转录组分析数据同样表明，s-NC 是比 CNC 更有效的 M1 极化诱导剂。基于这些发现，作者得出结论，纳米纤维素诱导巨噬细胞极化的能力受其物理化学性质（包括形状和表面电荷）以及潜伏期的深刻影响。孵育 1 天后，经 s-NC 处理的 M-CM 中 MG-63 细胞活力显着降低，证明其促炎特性导致癌细胞死亡。该研究表明，可以通过应用适当的纳米纤维素形状和大小以及孵育期来控制巨噬细胞极化。因此，作者假设纳米纤维素的几何形状和特性可以很容易地通过适当的化学部分进行修改，以满足所需的应用。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2022.120464
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