东南大学张袁健课题组概述了近年来通过模拟天然酶的结构特征以及变构调节来提高纳米酶的反应活性、选择性和催化多样性方面的重要进展，综述了纳米酶催化反应吸附态中间体、活性描述符和催化机制研究的精细结构表征手段、计算模拟方法和人工智能算法等研究策略，总结了纳米酶活性评估的现有技术和一些新兴的方法。
纳米酶作为人工模拟酶家族的新起之秀，不仅表现出与天然酶相似的催化活性，还具有稳定性高和制备成本低等优点，因而已经在生物传感、疾病治疗和环境治理等诸多领域崭露头角。然而，纳米酶的催化活性、底物选择性以及催化反应多样性与天然酶相比具有较大差异且催化机制不甚明确。因此，为了探寻纳米酶更深层次的应用，亟待科学家在分子层面上进行合理的结构设计并深入探寻其催化机制。
针对上述问题，东南大学张袁健课题组在SCIENCE CHINA Chemistry发表了题为“Molecular insights of nanozymes from design to catalytic mechanism”的综述文章，概述了近年来通过模拟天然酶的结构特征以及变构调节来提高纳米酶的反应活性、选择性和催化多样性方面的重要进展，综述了纳米酶催化反应吸附态中间体、活性描述符和催化机制研究的精细结构表征手段、计算模拟方法和人工智能算法等研究策略，总结了纳米酶活性评估的现有技术和一些新兴的方法（图1）。
图1. 纳米酶的仿生合成策略、氧化还原型纳米酶的催化机制以及活性评估总览图首先介绍了通过模拟天然酶的金属活性位点结构、底物结合口袋、支架以及变构调节纳米酶功能等仿生合成策略（图2）。譬如，为了模拟天然酶的高催化活性位点，研究人员将类酶金属活性中心结构引入纳米酶中，通过调控活性中心的电子结构和配位环境等来构建高活性纳米酶。为了模拟天然酶的高特异性底物结合位点，研究人员采用分子印迹技术，引入具有特异性识别序列的适配体、刻蚀底物通道等方法，有效地增强了纳米酶底物的富集以及特异性结合。通过模拟天然酶支架的三大功能，即提供限域反应环境、支撑活性位点和赋予酶特定的空间组织结构，研究人员构建了高效的酶模拟物。
图2. 仿生合成策略示意图。（a）模拟天然酶的几何结构（b）模拟天然酶的变构调节机制
除了提高纳米酶的活性和选择性，实现活性的可逆调控也十分重要。活性的可逆调控在生命系统中扮演着举足轻重的角色。生命过程往往需要一个“开关”，以确保生物系统中的酶处于适当的活性。天然酶中的变构调控机制就如同这个“开关”，在催化反应中通过调节因子与变构位点的结合改变构型构象；反应结束后，调节因子脱离变构位点，恢复构型构象，从而调控活性。然而，基于无机纳米材料的纳米酶由于其刚性属性缺乏结构灵活性，限制了对其活性的调控。借鉴模拟天然酶的变构调节机制是纳米酶实现活性可逆调控的一条重要研究思路。通过添加外部分子模拟变构调节中的调节因子，可实现对于纳米酶活性的可逆调控。例如，Rotello等人选择钌催化的脱烷基化反应作为生物正交催化模型，采用葫芦[7]脲（cucurbit[7]uril，CB[7]）作为调节因子，通过双N,N′-烯丙基氧羰基罗丹明110的烯丙基氨基甲酸酯的裂解反应来评估纳米酶的催化活性。动力学研究证实在体系中引入CB[7]分子后，纳米酶的活性几乎完全被抑制，而当加入CB[7]分子的竞争性客体分子1-金刚烷胺（ADA）后，纳米酶的活性则基本恢复。研究人员通过CB[7]分子与AuNP配体的主客体相互作用，模拟了天然酶的变构调节机制，实现了对纳米酶活性的可逆调控（图3a）。曲晓刚课题组使用光作为调节因子，利用偶氮苯（Azo）和β-环糊精（CD）间的可逆作用，在不添加外部分子的条件下实现了纳米酶活性的可逆调控（图3b）。使用大孔二氧化硅纳米颗粒（DMSN）作为催化支架稳定超小Pd纳米颗粒，与Azo开关结合后得到ASP，用N-烯丙基氧基羰基香豆素的裂解反应来评估纳米酶活性，证实与环糊精分子结合后得到的CASP，活性显著降低，这是由于环糊精分子与Azo的结合抑制了ASP的催化活性位点；当引入紫外光刺激之后，Azo发生异构化，环糊精分子被释放，纳米酶活性得到恢复。Liu等人使用环糊精作为客体分子，热敏聚合物聚(N-异丙基丙烯酰胺)以及谷胱甘肽过氧化物酶催化中心作为主体分子，引入温度作为调节因子，当温度提高到45℃时，纳米酶的形貌由管状转变为球状，活性几乎消失；当温度下降，形貌由球状转变回管状，活性又被“打开”（图3c）。图3. 典型的纳米酶变构调节模拟
上述的仿生策略显著提高了纳米酶的活性、选择性以及反应多样性，但是值得注意的是，过多的仿生设计可能会影响纳米酶的稳定性，因此，纳米酶的理性设计需要在催化活性、结构复杂性以及稳定性间进行合理的平衡。在纳米酶分子机制方面，主要以氧化还原型纳米酶为例，概述了两类典型的催化机制，第一类是电子转移机制，第二类是自由基机制（图4）。对于第一类机制，纳米酶表面丰富的活性位点使其可以实现电子从生物分子到底物氧气或者过氧化氢的快速转移。在这种机制中，生物分子作为电子供体，氧气或过氧化氢作为电子受体，完成催化循环。第二类自由基机制可分为游离态自由基（free ROS）机制和结合态自由基（bound ROS）机制。对于free ROS机制，游离的H2O2、1O2、•OH和O2•−等活性氧是引起催化反应的主要活性物质。其中，由Fenton reaction或者Haber-Weiss reaction生成的•OH被认为是最普遍且高效的活性氧物种。Bound ROS机制则是以金属-氧（M-O）活性中间体引起的催化反应。值得注意的是，这种M-O物种也是天然酶氧分子活化和氧化反应中的关键中间体。以典型的类过氧化物酶（POD）反应为例，free ROS机制可以描述为一分子H2O2与POD纳米酶反应生成•OH，随后•OH从底物分子中得到H+，从而完成底物氧化；bound ROS机制可以描述为一分子H2O2与POD纳米酶结合产生高活性的M-O中间体，随后M-O中间体从底物分子中夺得H+，进而完成催化过程。这两种机制的本质不同之处在ROS与底物分子发生反应时，ROS与纳米酶作用后是否仍呈现结合态。从纳米酶的定义看来，纳米酶反应可以使用天然酶的米氏动力学模型来描述。实际上多数氧化还原型纳米酶在反应时有多个底物参与。例如，同时存在O2/H2O2和酶底物。因此，从动力学角度看，纳米酶的动力学机制遵循酶的多底物动力学机制，如乒乓机制或序列机制等。虽然这部分的机制仍存在争议，但可在一定程度上揭示多底物同时存在时纳米酶与底物的结合顺序，帮助人们深入理解催化反应的动力学过程。图4. 氧化还原型纳米酶的催化机制示意图
目前，纳米酶活性的评估主要采用各种酶底物作为检测探针。从动力学的角度看，由于纳米酶具有在生理学条件下催化酶底物的优异性能，米氏动力学模型最早被提出作为评估纳米酶活性的基本准则。考虑到纳米酶分散性与天然酶的差异，也有研究者提出使用与异相催化剂类似的turnover frequency作为活性评估原则，并将这两种评估方法进行了详实的对比和讨论。值得注意的是，纳米酶驱动的类氧化酶反应通常是生命过程中需要活化氧气的反应，另一类需要氧气参与的经典反应类型是电化学氧还原反应（ORR）。受到它们活性来源相似的启发，一些天然氧化物酶已经被开发作为优异的电催化剂；相应地，一些性能优异的电催化剂也被发现具有类酶活性。最近的研究表明，类酶活性与ORR电化学活性之间有着强烈的内在联系，启示人们利用ORR作为纳米酶活性的潜在评估方法。例如，施剑林课题组以空心掺氮碳球为模型，开发出一系列单原子纳米酶，采用TMB的氧化作为模型显色反应评估其类氧化酶活性，结果表明Cu/Fe单原子纳米酶（CF-HNCS）具有显著的类氧化酶活性，进一步用线性循环伏安法（LSV）研究了所有样品在室温下的ORR活性，其ORR活性顺序与类氧化酶活性顺序高度一致。接下来，研究人员使用显色反应的无量纲速度（Vn）和ORR中的归一化平均电流密度（|jn|)）的绝对值分别用于表示各种催化剂的类氧化酶和ORR活性，结果表明Vn和|jn|在去离子水中具有良好的线性关系，成功将纳米酶氧化酶催化与氧还原电催化进行了桥联，构建了基于伏安技术的类氧化酶活性评估方法（图5a-c）。当使用ORR来评估纳米酶活性时，还需要特别注意催化剂的其它理化性质，如导电性。张袁健课题组通过热解策略合成出两种石墨化结构差别迥异的Fe-N-C纳米酶，它们驱动类氧化物酶反应和ORR反应的活性截然不同。从动力学角度看，材料的石墨化结构在ORR中极为重要，因为ORR反应中催化剂的石墨化结构，使得电子更容易从电极到达催化剂表面再传递给氧气（图5d），这正是大多数M-N-C材料用作ORR电催化剂合成时采用高温热解法的原因。然而纳米酶催化过程的电子交换主要发生在氧气和电子供体底物分子之间（图5e），电化学测试以及类氧化酶测试表明，较低温度合成的Fe-N-C电化学表现一般，但展现出极具竞争力的类氧化酶性能，表明在类氧化酶活性中石墨化结构可能并不像在ORR中那样不可或缺。图5. 桥联类氧化酶活性与ORR催化活性的新型纳米酶活性评估方法
本文综述了纳米酶通过模拟天然酶的结构（金属活性中心、底物结合口袋和催化支架）以及功能（变构调节）实现活性提升以及活性调控的研究进展，从分子层面上将氧化还原型纳米酶的催化机制总结为游离态自由基路径（free ROS）以及结合态自由基路径（bound ROS），并通过纳米酶催化反应的吸附态中间体、活性描述符对催化反应路径和活性预测进行了归纳，概述了利用ORR活性来评估纳米酶活性的新兴方法。最后作者提出，虽然目前纳米酶通过仿生设计策略已经取得了长足进步，但其在生理学条件下的催化表现还远不及天然酶，因此如何构建生理学条件下具有显著优势的纳米酶以适应纳米医学应用是未来一个重要的研究方向。此外，学习生命运动的基本原理，将其应用于探索生物进化过程中不曾出现的工业反应纳米酶，也是一个非常有趣的研究课题。详见：Xu Y, Zhou ZX, Deng NK, Fu KC, Zhu CX, Hong Q, Shen YF, Liu SQ; Zhang YJ. Molecular insights of nanozymes from design to catalytic mechanism. Science China Chemistry, 2023, DOI: https://doi.org/10.1007/s11426-022-1529-y.
张袁健，东南大学青年首席教授，博士生导师、副院长，入选国家青年海外高层次人才和国家万人计划科技创新领军人才计划。1998年-2007年先后在南京大学基础学科教学强化部和中国科学院长春应用化学研究所学习获学士和博士学位，2008年–2012年先后在德国马普胶体界面研究所和日本国立物质材料研究所国际青年科学家中心从事科研任博士后和ICYS Researcher，2012年起受聘于东南大学化学化工学院。长期从事基于富碳材料的分子传感（Carbosensing，“碳”测）研究，已在J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Chem、Nat. Commun.、CCS Chem.、Anal. Chem.等发表论文100余篇。研究成果受到国际国内同行的广泛关注，所发表论文被引用16,000余次，H-index 63。作为项目负责人承担国家自然科学基金委、江苏省科技厅、日本学术振兴会等相关科研项目，兼任江苏省材料学会常务副理事、Chinese Chemical Letters（中国化学快报）副主编等。
课题组网站: https://carbosensing.group/
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