万字长文综述靶向蛋白降解（TPD）：PROTAC、LYTAC、分子胶、光控PROTAC...

背景介绍

图1 UPS介导的蛋白质降解

近年来，UPS诱导蛋白质降解取得了巨大进展，特别是Crews团队2001年提出的蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）技术。在此项研究中，卵假散囊菌素与磷酸肽IκBα连接，IκBα可以识别并与E3连接酶复合物SCFβ-TRCP相互作用，从而获得PROTAC1（图2）。卵假散囊菌素是一种抗蛋氨酸氨基肽酶-2（MetAP-2）的共价抑制剂，能够催化从新生肽中去除N端蛋氨酸。因此，将预孵育的混合物1和MetAP-2混合物添加到未受精的非洲爪蟾卵的提取物中时，发现PROTAC1以剂量依赖性的方式降解MetAP-2。

图2 首次报道的PROTAC结构

PROTAC是一种双功能分子，包含两个“弹头”，由连接子连接，一个弹头与目标蛋白（POI）结合，另一个与E3连接酶结合。在三元配合物（POI：PROTAC：E3）形成后，POI被多泛素化并被蛋白酶体降解。PROTAC可以循环使用，并持续催化另一个降解过程（如图3）。三元配合物的形成是发挥PROTAC作用的关键步骤。

图3 PROTAC的作用方式

PROTAC的作用方式明显不同于小分子抑制剂，小分子只占据POI的活性位点，而不是加速其降解。因此，与小分子抑制剂相比，PROTAC表现出了许多优势：(1)PROTAC以事件驱动而不是占用驱动的方式发挥作用，因此PROTAC在催化量下足以产生良好的药理效果。相比之下，小分子抑制剂总是需要高细胞浓度才能有效地占据POI的活性位点，往往导致剂量依赖性毒性。(2)许多蛋白质，如转录因子、支架蛋白和非酶蛋白，很难被传统的小分子抑制剂来解决，因此它们被定义为“不可成药靶点”。(3)小分子抑制剂通常只破坏POI的一个结构域，而使其他疾病相关结构域的活性保持完整，而PROTAC通过降解整个POI来破坏所有结构域的功能。(4)PROTAC克服获得性耐药性这一棘手的问题，并有规避或推迟耐药性发生的潜力。(5)PROTAC可以实现较高的靶点特异性，而小分子抑制剂要区分与POI密切相关的亚型则具有挑战性。PROTAC日益成为医学研究领域的焦点，超过70种蛋白质被PROTACs靶向降解。

02

PROTAC配体研究进展

（1）CRBN配体：沙利度胺（图4）由Chemie Grünenthal公司开发，于1954年作为孕期的止吐药上市。然而，沙利度胺由于其严重的致畸作用被撤市，直到其免疫调节和抗炎作用被披露后才被继续使用。最初认为沙利度胺的S（−）对映体具有致畸作用，而R（+）对映体具有镇静作用。当分离出这两种对映体后，发现它们在生理条件下迅速相互转化。此外，最近证实了R和S对映体在新西兰兔模型中均具有致畸作用。因此，沙利度胺仍然以外消旋体进行使用。

图4 IMiDs的化学结构

沙利度胺及其类似物也被称为免疫调节药物（IMiDs，图4），现在用于治疗血液肿瘤：包括最初诊断的多发性骨髓瘤（沙利度胺）、难治性多发性骨髓瘤（来那度胺和波马利度胺）和5q缺失相关的骨髓增生异常综合征。长期以来，这些IMiDs的确切靶点一直不清楚，直到2010年证明沙利度胺靶向E3连接酶，即cereblon（CRBN）。从那时起，IMiDs分子机制的神秘面纱逐渐被揭开。CRBN是E3连接酶复合物CUL4-RBX1-DDB1-CRBN（CRL4CRBN）的一个组成部分，可作为底物受体。随后的研究表明，来那度胺加速IKZF1、IKZF3、酪蛋白激酶1 α（CK1α）和ZPF91的降解。Thoma团队揭示了硫胺：DDB1：CRBN的共晶结构，明确阐明了沙利度胺的结合模式（图5）。化合物5（图4），含有异喹啉-1（2H）单元，是一种IMiD，也能够与CRBN结合并诱导底物降解。来那度胺衍生物，发现化合物6（图4）通过与CRBN相互作用导致翻译终止因子G1降解为GSPT1。化合物7（图4）作为靶向BRD4的PROTACs的CRBN配体。

（2）VHL配体：VonHippel-Lindau（VHL）是E3连接酶复合物CUL2-RBX1-ElonginB-VHL-VHL（CRL2VHL）的底物受体成分。除CRBN配体外，VHL配体也受到高度关注。在PROTAC研究中被广泛用作E3配体。

缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）增强了促红细胞生成素的表达。HIF-1α在许多生物学反应中发挥重要作用，例如代谢重编程活性氧（ROS）的产生，血管生成、上皮-间质转化和癌症转移。在HIF-1α与VHL相互作用的基础上，挖掘出一种七肽（ALAPYIP）作为第一个VHL配体。然后，利用计算机辅助设计发现了化合物8（图6）作为小分子VHL配体。化合物9（Kd = 185 nM，图6），其与VHL的亲和力远高于化合物8（Kd = 5300 nM）。此外，用1‐fluorocyclopropyl（10，Kd = 90 nM，图6）或1‐cyanocyclopropyl（11，Kd = 80 nM，图6）取代9的叔亮氨酸残基上的乙酰基，显著提高了活性。对几种VHL配体进行了比较，证明将一个甲基偶连在8位苄基上的亚甲基上有利于其活性提高（12，图6）

图6 VHL配体。

从9与VCB配合物的共晶结构可以看出（图7），叔亮氨酸残基上的氨基和苯基的苯基一侧是溶剂暴露区，可以连接连接物用于合成PROTACs。需要注意的是，乙酰基上的碳基通过水分子介导与Asn67和His115形成氢键，因此在合成PROTACs时，应保留碳基，以保持与VHL较高的结合亲和力。

图7 化合物8与VCB的共晶结构

（3）MDM2配体：MDM2是一种E3连接酶，能够加速肿瘤抑制因子p53的降解。MDM2是肿瘤治疗的重要靶点。

为了破坏MDM2-p53蛋白-蛋白相互作用（PPI）并上调p53的表达，确定Nutlin-3（图8）为MDM2配体，对MDM2抑制活性（IC50 = 90 nM）。Nutlin-3的进一步结构优化产生了化合物15（图8），其活性显著提高（IC50= 18 nM）。用吡咯烷骨架（16，图8）取代二氢咪唑（15，图8）是一个良好的结构修饰，其中16（图8）表现出更高的活性（IC50= 6 nM）。带有吡啶的其他MDM2配体（17和18，图8）、哌啶-2-1（19，图8)或二氢异喹啉酮（20，图8）的骨架也有报道。

图8 MDM2配体

（4）IAPs配体：IAP与化疗耐药、疾病进展和不良预后密切相关，其成员包括XIAP、cIAP1、cIAP2、LIVIN/ML-IAP和ILP，也可以作为E3连接酶。IAPs配体被广泛开发，并不断出现在已报道的PROTAC分子中，特别是cIAP1配体是被研究最多的IAPs配体之一。

甲基抑抑素（MetBS，图9）能够与cIAP1相互作用，促进cIAP1的自泛素化和降解。22（图9）及其衍生物为IAPs拮抗剂。22比MetBS表现出更高的结合亲和力。此外，23（图9）是一种基于结构的药物设计策略的pan-IAP拮抗剂。

基于IAP配体的PROTACs称为特异性和非遗传的IAP-依赖蛋白擦除器（SNIPERs），是针对ER、BRD4和BCR-ABL等有效降解物。

图9 IPAs配体

（5）其他的E3配体：所报道的其他E3配体列于表1。化合物24和29（表1）分别来源于与KEAP1和RNF114 E3连接酶共价连接的天然产物。

表1 其他E3配体或其相应的PROTACs

靶向激酶的PROTAC研究进展

（1）靶向BCR-ABL的PROTACs：BCR-ABL融合蛋白参与慢性髓系白血病的发生和发展。将BCR-ABL抑制剂伊马替尼、波沙替尼或达沙替尼与VHL配体9（图6）或CRBN配体波马利度胺（图4）结合，合成了一系列的PROTACs。34（图10）在1000 nM浓度下具有较好的降解活性，降解率为60%。PROTAC34能有效抑制K562细胞系的增殖，IC50为4.4 nM。此外，通过改变BCR-ABL或E3配体（VHL或CRBN配体），可以显著改变PROTAC的选择性。随后，利用针对BCR-ABL1的变构抑制剂GNF-5发现了PROTAC 35（图10）对BCR-ABL1具有亚微摩尔降解活性（DC50 = 340 nM）。在35的基础上合成36（图10），降解活性（DC50 = 30 nM）增强。

图10 针对BCR-ABL的PROTACs

基于IAP的PROTACs（也称为SNIPERs）37（图10）为BCR-ABL降解剂。37由一个CIAP1结合弹头（抑制部分）、一个BCR-abl结合弹头（达沙替尼部分）和一个烷基连接子组成。37在浓度高达30,000 nM时对BCR-ABL具有降解活性。22（图9）与IAPs具有更高的结合亲和力，当作为E3配体时，能够提高对BCR-ABL的降解活性（38，图10）。在10 nM浓度下，BCR-ABL的降解率达到50%以上。此外，38在抑制BCR-ABL下游信号通路方面比其亲本化合物达沙替尼显示出更持久的作用。在HG-7-85-01为BCR-ABL配体的情况下，VHL配体9（图6）在几种E3配体中最合适，相应的PROTAC 39（图10）在100 nM诱导BCR-ABL50%的降解。用波马利度胺（图4）或图22（图9）取代39的E3配体显著降低了脱氧活性，这表明PROTAC招募的不同E3连接酶与POI具有不同的协同性。BCR-ABL变构抑制剂ABL001 PROTAC 40（图10）作为一种有效的BCR-ABL降解剂，能够在30 nM时诱导BCR-ABL近50%的降解。

PROTAC 41和VHL配体9达沙替尼（图10）可显著促进BCR-ABL降解（DC50 = 8.5 nM），可抑制BCR-ABL驱动的K562细胞系（IC50= 24 nM）的增殖。体内研究显示，41在15mg/kg/d的剂量下显著减弱了K562异种移植小鼠模型的肿瘤生长。在点击化学平台的基础上合成了一个含有不同BCR-ABL配体的PROTACs库。PRTOAC 42（图10）作为一种有效的BCR-ABL降解剂（DC50 = 20 nM），对K562细胞系（IC50= 7.5 nM）表现出纳摩尔的抗增殖活性。此外，耐药的BCR-ABL突变体（BCR-ABLT315I）也对42敏感。基于IMiDs的叠氮化物化合物，并通过点击化学与BCR-ABL配体连接，以获得PROTACs。在这些PROTACs中，43在低至10 nM的浓度下对BCR- ABL具有较强的降解活性，并且对K562细胞系（IC50= 1.50 nM）具有较高的抗增殖活性。

采用nimbolide（表1）作为E3配体，发现PROTAC 44（图10）招募RNF114 E3连接酶。与上述BCR-ABL降解物相比，44在BCR-ABL和c-ABL之间具有更高的选择性，这表明被招募E3的连接酶是PROTAC选择性的关键决定因素之一。

（2）靶向Bruton's酪氨酸激酶（BTK）的PROTACs：BTK由BTK基因编码，除T淋巴细胞外，其余均在造血系统中表达。BTK与B细胞的增殖、分化和存活相关，使其成为非霍奇金淋巴瘤（NHL）治疗的重要靶点。靶向BTK的PROTACs如图11所示。

图11 靶向Bruton's酪氨酸激酶（BTK）的PROTACs

基于伊布替尼的PROTAC 46（图11）能有效诱导HBL1细胞（DC50 = 6.3 nM）和其他NHL细胞系的BTK降解。46还能显著抑制HBL1细胞系的增殖，其半抑制浓度值为1.5 nM，略低于伊布替尼（IC50= 2.5 nM）。重要的是，含有耐药的BTKC481SHBL1细胞系对46也有显著应答。使用BTK抑制剂CGI1746作为BTK配体，发现了PROTAC 47（图11）。47在Ramos细胞中对BTK和在TMD8细胞中对BTKC481S具有较强的降解活性。此外，47对IKZF1和IKZF3也有效，并加速其降解。Mino细胞系的增殖被47明显抑制，IC50为12 nM。体内研究表明，47在DFBL-96069移植小鼠中，以50mg/kg/天的剂量显著降低了移植小鼠的肿瘤负荷。

以伊布替尼为基础的PROTAC 48（图11）在XLA细胞系中对BTK（DC50 = 14.6 nM）和BTKC481S（DC50 = 14.9 nM）具有较强的降解活性。由于48的药代动力学特性较差，进一步优化了48的结构，使用来那度胺作为CRBN配体合成PROTAC 49（图11）。保持强大的降解活性，49比48表现出更好的药代动力学特性。延长连接子的长度有利于三元配合物的形成，提高了降解活性。

（3）靶向细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的PROTACs：CDK是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，调节细胞周期（CDK1、CDK2、CDK4、CDK6）和基因转录（CDK7-13）。CDK有20个成员，其中许多成员已被证明与肿瘤的发生和发展密切相关，使它们成为癌症治疗的重要靶点。

靶向CDK9的PROTACs：PROTAC 60（图12）可以选择性诱导CDK9的降解，同时保留CDK2、CDK5、蛋白激酶B（AKT）、IκB激酶β（IKKβ）和黏附激酶（FAK）。基于CDK抑制剂BMS-387032的PROTAC 61能够以CRBN依赖的方式选择性地诱导CDK9的降解。在250 nM的浓度下，CDK9在MOLT4细胞系中完全缺失，同时CDK2和CDK7的降解非常有限。相反，当BMS-387032被选择性有效的CDK9抑制剂NVP-2（半抑制浓度=0.514nM）作为CDK9配体取代，产生PROTAC 62时，降解活性降低（图12）。

图12 靶向CDK9的PROTACs

PROTAC 63是一种有效的CRBN招募CDK9降解剂。63在1000 nM浓度下，诱导CDK9降解大于50%，而CDK2、CDK4、CDK5、CDK7和CDK8完好无损。采用选择性CDK9抑制剂BAY 114357作为CDK9配体，PROTAC 64在MV4；11细胞系中发现对DCK9的DC50值为7.62 nM。64对MV4；11细胞系（25 nM）也表现出良好的抗增殖活性。此外，体内研究显示，64使CDK9在20 mg/kg剂量下在3h后显著降解。

靶向CDK6的PROTACs：靶向CDK6的PROTACs如图13所示。Palbociclib是一种CDK4和CDK6的双重抑制剂，在这两个靶点之间的抑制活性相当。尽管Palbociclib对CDK4和CDK6表现出双重抑制作用，但65选择性地加速了CDK6的降解，而由于无法诱导三元配合物（CDK4：62：CRBN）的形成，62、65几乎不影响CDK4。此外，65对CDK6依赖的细胞系比CDK4依赖的细胞系表现出更强的抗增殖活性。基于palbociclib的PROTAC 66（图13）为选择性CDK6降解剂。

以palbociclib作为CDK配体，通过改变连接子长度和改变E3配体，合成了一系列的PROTACs。只有CRBN配体对CDK6有效，并发现PROTAC 67（图13）具有显著的降解活性和高选择性。PROTAC 68（图13）选择性降解CDK6。上述CDK6靶向的PROTACs招募了CRBN，通过筛选多个E3配体发现了VHL招募的PROTAC 69。69是一种有效的CDK6降解剂，DC50值为5.1 nM。

靶向CDK8的PROTACs：天然产物皮质抑素A（图14）是一种选择性的CDK8抑制剂（IC50= 15 nM）。然而，就像大多数天然产物一样，皮质抑素A的合成也充满了挑战。通过简化的合成获得了有效的CDK8抑制剂JH-VIII-49（图14，IC50= 16 nM），活性与皮质抑素A相当。使用JH-VIII-49作为CDK8的配体，发现了PROTAC 72（图14），它在1000 nM浓度下显著诱导了Jurkat细胞中CDK8的降解。

图14 靶向CDK8的PROTAC和抑制剂

靶向CDK2的PROTAC和靶向CDK2和CDK9的PROTAC:在泛CDK抑制剂AT-7519和FN-1501的基础上报道了PROTAC 73和74（图15）。73选择性地促使CDK2在1000 nM浓度下降解，并显示出对PC‐3细胞系的细胞活性（IC50=840 nM），与AT‐7519相似。相比之下，74能够在PC-3细胞系中同时诱导CDK2（DC50 = 62 nM）和CDK9（DC50 = 33 nM）的降解。74对PC-3细胞系的IC50值为120 nM。

图15 靶向CDK2和靶向CDK2和CDK9的PROTAC

靶向CDK4的PROTAC和靶向CDK4和CDK6的PROTAC:通过改变PROTAC的POI配体，可以实现较高的目标选择性。基于核糖体的PROTAC 75和76（图16）。75可以选择性地加速Jurkat细胞系中CDK4的降解，而76对CDK4和CDK6均有效。此外，76可以以CRBN依赖的方式将Jurkat细胞阻滞在G1期。多靶点PROTAC 56对多个CDK成员也表现出降解活性。

图16 靶向CDK4和靶向CDK4和CDK6的PROTAC

（4）靶向EGFR的PROTAC

基于第一代表皮生长因子受体（EGFR）-酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的PROTACs：EGFR的突变和过表达与非小细胞肺癌（NSCLC）的发生发展密切相关，这使EGFR成为NSCLC治疗的重要靶点。

使用第一代EGFR-TKI吉非替尼作为EGFR配体，VHL招募的PROTAC 77在HCC827细胞中对EGFRdel19具有良好的降解活性（DC50 = 11.7 nM）。在拉帕替尼的基础上合成的PROTAC 78（图17）可诱导OVCAR8细胞中EGFRWT（DC50 = 39.2 nM）的降解，而在Hela细胞中对EGFRexon20ins（DC50 = 736.2 nM）的活性较低。78对表皮生长因子受体2（HER2）有效，并能显著抑制HER2驱动的SKBr3细胞系（IC50= 102 nM）的增殖。EGFR的降解对下游效应分子AKT、糖原合酶激酶-3β和细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）的磷酸化产生了比单纯的抑制有更持久的影响，说明了降解比抑制的优势。starvation可以提高吉非替尼衍生的PROTAC 79的降解活性（图17），在HCC827细胞中，starvation对EGFRdel19的DC50值为5.0 nM。79可以通过减少下游分子的磷酸化来显著阻断EGFR信号通路。

图17 基于第一代EGFR-TKIs的PROTACs

含嘌呤的PROTAC 80（图17），在HCC827细胞系中对EGFRdel19具有优异的降解活性（DC50=0.51 nM）。80还能有效诱导H1975细胞系中耐药突变体EGFRL858R/ T790M（DC50 = 126.2 nM）的降解。此外，PROTAC诱导的EGFR降解与自噬有关。由奥拉帕尼（聚（adp-核糖）聚合酶（PARP）配体）、吉非替尼（EGFR配体）和VHL配体组成的三价PROTAC 81（图17）能够诱导PARP和EGFR的降解，但对H1299细胞系（IC50= 19920 nM）。

基于第二代或第三代EGFR-TKIs的PROTACs：阿法替尼是第二代EGFR-TKI。以阿法替尼为基础合成了PROTAC 82（图18）在H1975细胞系（DC50 = 215.8 nM）中对EGFRL858R/T790M具有中度降解活性。

使用第二代EGFR-TKI卡纳替尼作为EGFR配体的PROTAC 85（图18）。85对EGFRdel19（DC50=30-100nM）和EGFRL858R/T790M（DC50 < 30 nM）均具有较强的降解活性。85对PC9（IC50= 3.942 nM）和H1975（IC50= 26.52 nM）细胞系表现出较强的细胞活性。研究证实，EGFR通过劫持UPS和自噬-溶酶体系统来降解目标蛋白。

利用第三代EGFR-TKI作为弹头，通过改变连接体和E3配体合成了一系列PROTACs。在H1975细胞中，最有效的PROTAC 83（图18），对EGFRL858R/T790M的DC50值为5.9 nM。然而，83对H1975细胞系（IC50= 510 nM）表现出较差的细胞活性。奥西替尼衍生的PROTAC 84（图18），在浓度为10000nM时，能够促进PC9细胞中EGFRdel19的降解。

图18 基于第二代或第三代EGFR-TKIs的PROTACs

基于第四代EGFR-TKI的PROTACs：使用第四代EGFR-TKI 86（图19）作为EGFR配体的CRBN-招募PROTAC 87（图19）和VHL-招募PROTAC 88（图19）。87和88是有效的EGFRdel19降解剂（DC50 =分别为45.2和35.8）。HCC827对87和88敏感，IC50分别为180和220 nM。但缺点在于，两种PROTACs对EGFRL858R/T790M的活性非常差。此外，87和88分别被证明能够诱导HCC827细胞凋亡，并将HCC827细胞阻滞在G1期。

图19 基于第四代EGFR-TKI的PROTACs。

基于变构EGFR-TKI的PROTAC：EAI001（图20）是一种有效的变构物EGFR-TKI。将EAI001衍生物与波马利度胺结合，合成了PROTAC 90（图20）。90能够有效诱导双突变体（EGFRL858R/T790M）和三突变体（EGFRL858R/T790M/C797S和EGFRL858R/T790M/L718Q）的降解。细胞活性评价表明，90能有效抑制EGFRL858R/T790M（IC50= 96 nM）和EGFRL858R/T790M/C797S的增殖。

图20 基于变构EGFR-TKI的PROTAC。

（5）靶向ALK的PROTACs：ALK是一种受体酪氨酸激酶，最初在间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）的染色体易位中发现ALK融合蛋白（NPM-ALK和EML4-ALK）有助于ALK的持续激活，导致肿瘤的发生和肿瘤的发展。ALK的异常激活涉及多种肿瘤，包括ALCL、NSCLC、弥漫性大B细胞淋巴瘤、乳腺癌、结直肠癌、炎性肌纤维母细胞瘤、食管鳞状细胞癌和肾细胞癌。此外，ALK的点突变与神经母细胞瘤相关。因此，AKL是治疗癌症最重要的靶点之一。

ALK抑制剂塞瑞替尼衍生的PROTAC 91（图21）可有效降低SU-DHL-1细胞中NPM-ALK（DC50 = 3 nM）和H2228细胞中EML4- ALK（DC50 = 34 nM）的水平。91能显著抑制SU-DHL-1细胞系（IC50= 46 nM）的增殖。体内研究表明，在给药后12h（50mg/kg，腹腔注射），91在小鼠体内的血药浓度可达到340 nM，远高于其对SU-DHL-1细胞系的IC50值。基于塞瑞替尼的PROTAC 92（图21）以UPS依赖的方式显著加速了NSCLC细胞H3122（DC50 = 10 nM）和ALCL细胞Karpas 299（DC50 = 40 nM）中ALK的降解。与上述CRBN招募的PROTACs不同，含有VHL配体的PROTAC 93（图21）能有效诱导ALK降解，抑制SU-DHL-1（半抑制浓度= 58 nM）和H3122（半抑制浓度= 180 nM）细胞系的增殖。

图21 针对ALK的PROTACs

布加替尼是第二代ALK抑制剂，于2017年被批准用于治疗ALK阳性转移性NSCLC。当与EGFR抗体联合使用时，布加替尼能够克服三重突变体EGFR引起的耐药。PROTAC 95（图21）作为一种有效的ALK降解剂，可有效杀死SR细胞（DC50 = 7.0 nM）中的ALK，并显著抑制SR（半抑制浓度= 1.7 nM）和H2228（半抑制浓度= 46 nM）细胞系的增殖。95可以在293 T细胞中诱导耐药突变体ALKG1202R（DC50 < 200 nM）的降解。95对293T细胞系IC50值为146.4 nM，超过了布加替尼。CRBN-招募的PROTAC 96（图21），对SR细胞系具有强大的细胞活性，IC50值为2.0 nM，略低于布加替尼（IC50= 3.3 nM）。96在低至10 nM的浓度下均能显著诱导ALK的降解。

采用第二代ALK抑制剂阿利替尼作为ALK配体，发现了PROTAC 97（图21）。97在H3122（DC50 = 27.4 nM）和Karpas（DC50 = 116.5 nM）细胞系中对ALK具有纳摩尔级降解活性。体内研究表明，Karpas 299细胞异种移植模型给予97（10mg/kg/d）可减轻肿瘤重量75.82%，超过阿利替尼，20mg/kg/d时，肿瘤重量减轻63.82%。

（6）靶向B-RAF的PROTACs

B-RAF属于RAF家族，是RAS-RAF- MEK-ERK信号通路的一个重要节点。B-RAF的突变和过表达被认为是促进了肿瘤的发生和进展。针对B-RAF的PROTACs如图22所示。

图22 针对B-RAF的PROTACs

PROTAC 98（图22）在5000 nM浓度下可有效诱导MCF-7细胞中B-RAF的降解。B-RAF抑制剂BI882370衍生的PRTOAC 99能够显著降低A375细胞中B-RAFV600E（DC50 = 15 nM）的水平，而保留野生型B-RAF（B-RAFWT）。vemurafinib作为B‐RAF配体发现了PROTAC 100（图22），100在SK‐MEL‐28细胞中具有优异的抗B‐RAFV600E活性（DC50=6.8 nM，Dmax=95%），而抗B‐RAFWT活性较差。此外，100（EC50 = 37 nM）对SK-MEL-28细胞系的抗增殖活性优于vemurafinib（EC50 = 215 nM）。

（7）靶向其他激酶的PROTACs：靶向其他激酶的PROTACs见表（2）

表2 靶向其他激酶的PROTACs

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靶向核受体（NR）的PROTACs研究进展

NRs是一个配体激活的转录因子家族，包括约48个成员，负责调控基因转录。NRs与许多生理和病理过程，如转移、生殖、衰老和癌症等过程有很大关系。雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）对前列腺癌和乳腺癌的治疗备受关注。

（1）靶向ER的PROTACs：靶向ERα的PROTAC 124（图23），由雌二醇作为ERα配体和IκBα磷酸肽（DRHDSGLDSM）组成，识别并与SCFβ-TRCP E3连接酶结合。124在10,000 nM浓度下，可促进ERα的泛素化，并有效诱导ERα的降解。然而，由于膜通透性较低，124只能通过微注射给药。为了提高渗透性，用VHL-招募的五肽取代了124的IκBα磷酸肽，产生了125（图23）。125可以增强ERα的泛素化，并促进其降解。该团队通过改变雌二醇连接体的系结位点，进一步优化了125的结构，最终得到PROTAC 126（图23）。浓度为25000 nM时，126显著增强了MCF-7细胞中ERα的降解。对126进一步修改得到了PROTAC 127（图23），可以在96 h后降解整个ERα。使用短连接子的PROTAC通常比使用长连接子的更有效。

图23 针对ERα的PROTACs

小分子PROTACs比肽型的PROTACs更具优势。将ERα配体他莫昔芬与cIAP1配体抑抑素连接，合成能够以蛋白酶依赖的方式促进ERα降解的PROTAC 128（图24）。为了进一步提高降解活性，将IAP配体从抑抑素变为22（图9），与IAP具有更高的结合亲和力，在MCF-7细胞（DC50 = 3 nM）中具有良好的降解活性。对129的IAP配体（与cIAP1的结合亲和力：IC50= 450 nM）进行深入优化，以增强结合亲和力。筛选出了PROTAC 130（与cIAP1的结合亲和力：IC50= 74 nM，图24），显著降解活性（半抑制浓度< 3 nM）。此外，130在体外抑制肿瘤细胞增殖和在体内抑制肿瘤生长方面超过了129。131在MCF-7细胞中是一种高效的ER降解剂，DC50值为0.17 nM，对MCF-7细胞系具有显著的抗增殖作用（半抑制浓度= 0.77 nM）。耐药突变体ERY573S和ERD538G在100 nM浓度的存在下显著降解，这表明PROTAC具有克服耐药的能力。

图24 靶向ER的小分子PROTACs

PROTAC 132（图24）对ERα（DC50 = 1.1 nM）表现出显著的降解活性，显著抑制MCF-7细胞系（半抑制浓度= 13.2 nM）的增殖。PROTAC 133是由阿斯利康发现，其DC50值为0.3 nM。雌二醇衍生的PROTAC 134（图24）不仅可以有效诱导ERα的降解，还可以有效诱导ERβ和G蛋白偶联雌激素受体的降解。PROTAC 135（ARV-471，图24），进入了治疗晚期和转移性乳腺癌的三期临床试验。

（2）靶向AR的PROTACs：AR对前列腺癌的发生发展有很大的作用，使其成为前列腺癌治疗的重要靶点。ALAPYIP肽可以被VHL识别和捕获。为了提高该肽的通透性，加入了一段多聚d-精氨酸，并进一步与双氢睾酮结合生成PROTAC 136。136可以诱导绿色荧光蛋白（GFP）-AR的降解。用含羟基脯氨酸的五肽作为VHL配体，合成了具有细胞通透性的PROTAC 137（图25）可诱导AR降解。

图25 靶向AR的肽PROTACs

肽类PROTACs经常存在不稳定和细胞通透性差的问题。为了克服这些缺点，将AR配体R-2与MDM2配体nutlin-3连接起来（图8），构建了一个小分子PROTAC 138（图26）。在10,000 nM的浓度下，138能有效地加速AR的降解。138是第一个促进了PROTACs在化学生物学和药物开发中的全小分子PROTAC。

图26 靶向AR的PROTAC

基于SNIPER技术，合成了IAP招募的PROTAC 139（图26），在3000 nM浓度下可显著增强22Rv1细胞AR的降解，并诱导VCaP细胞系凋亡。同时，PROTAC 140（图26）是一种高效的AR降解剂，VCaP细胞的DC50值为5 nM。此外，耐药的AR突变体对140有反应。尽管AR的过表达导致了对苯鲁胺的耐药，140仍然保持了对前列腺癌细胞的抗增殖活性。

VHL配体与含有四甲基环丁烷的AR拮抗剂偶联，合成了一系列PROTACs。其中，具有刚性连接子的PROTAC 141（图26）在AR阳性的LNCaP和VCaP细胞中表现出最强的降解活性，DC50值分别为0.86和0.76 nM。此外，141对LNCaP和VCaP细胞系具有良好的细胞活性，IC50小于1 nM。PROTAC 142的活性（图26）的活性与141相当。将142的VHL配体中引入一个4-甲基噻唑基，得到PROTAC 143（图26）。143能有效促进LNCaP细胞（DC50=8nM）中AR的降解，并显示出比恩扎鲁胺更高的抗VCaP细胞系增殖活性。

图26 靶向AR的PROTACs

CRBN招募的PROTAC144（图26）是一种有效的AR降解剂（LNCaP细胞中的DC50=12.5nM），在肝微粒体中表现出良好的稳定性、药代动力学特性和体内抗肿瘤活性。PROTAC 145（图26），在斑马鱼的VCaP细胞异种移植物中显示出显著的抗肿瘤活性。含氯乙酰胺的DCAF11配体，与AR配体结合，合成了有效的AR降解剂146（图26）。PROTAC 147（ARV-110，图26）为一种抗前列腺癌药物，已进入II期临床试验。

（3）靶向雌激素相关受体（ERRα）的PROTACs：ERRα作为NR成员之一，是与代谢和能量稳态相关的基因表达调节因子。将含噻唑烷二酮的ERRα配体与VHL配体偶联，得到PROTAC 148（图27）。结果表明，MCF-7细胞中的ERRα在148的存在下可有效降解，DC50值为100 nM。此外，148能显著促进MDA-MB-231细胞移植物体内心脏和肾脏ERRα的降解。PROTAC 149在浓度低至3 nM时，能够加速ERRα的降解。

图27 靶向ERRα的PROTACs

05

靶向其他蛋白质的PROTACs

（1）靶向BET家族的PROTACs：BET蛋白作为表观遗传的“阅读器”，能够与组蛋白和非组蛋白的乙酰化赖氨酸残基特异性地相互作用，以调节染色质动力学和基因转录。BET蛋白（包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT）包含两个溴结构域（BD）和一个外星结构域（ET）。

利用OTX015（图28）作为靶向BRD4的PROTAC 152。152在Namalwa和CA-46细胞中对BRD4（DC50 < 1 nM）表现出显著的降解活性。与BRD4抑制剂OTX015和JQ1相比，152更抑制下游c- MYC的表达，诱导BL细胞凋亡，抑制其增殖。基于JQ1的PROTAC 153（图28），可以通过劫持CRBN和蛋白酶体使MV4；11细胞中BRD4的完全降解。

图28 针对BET蛋白的PROTACs和抑制剂

随后，VHL-招募的PROTAC 154（图28）可有效诱导BRD2/3/4的降解，并促进CRPC细胞系的凋亡。与JQ1和OTX015相比，154可以显著降低VCaP细胞中AR的表达。体内研究表明，在30mg/kg/d的剂量下，154能够缩小22Rv1细胞异种移植物的肿瘤体积。将MDM2配体16（图8）与JQ1连接，获得PROTAC 155（图28），在HCT116细胞（DC50 = 32 nM）中对BRD4具有较强的降解活性。

PROTAC 156对BRD4的选择性高于BRD2和BRD3（图28），在100 nM可显著促进BRD4的降解。从三元配合物BRD4BD2：156：VCB的共晶结构（图29）中可以看出，叔丁基投射出一个向量，直接连接到JQ1部分。因此，从叔丁基中启动一个连接子，与JQ1结合合成PROTAC 157（图28）。观察到157选择性地促进了BRD4的消耗，而BRD2和BRD3几乎不受影响。在共晶结构解析的基础上，设计并合成了大环PROTAC 158（图28），其活性与156相当。此外，通过求解VHL：158：BRD4BD2的共晶结构，证实了三元配合物的形成。为大环PROTACs的研究提供了线索。

图29 BRD4BD2：156：VCB的共晶结构和156的化学结构

以BET抑制剂作为BET配体合成了一系列PROTACs。其中，PROTAC 159（图30）对BET表现出皮摩尔降解活性，对RS4；11细胞系具有抗增殖活性。在5mg/kg/d的剂量下，159可以减少RS4；11细胞异种移植模型的肿瘤体积。对JQ1的结构进行了优化，发现了新的有效的BET抑制剂QCA276，并在此基础上发现了PROTAC 160（图30）。160细胞维持了皮摩尔降解和细胞活性。更重要的是，在给药2周后，160剂量为5 mg/kg时，细胞异种移植物的肿瘤几乎消失。

以点击化学为基础，合成了一组JQ1衍生的PROTACs。最终，基于中尺度诊断分析，筛选出CRBN-招募PROTAC 161（图30）作为最有效的BRD4靶向PROTAC，在NCI-H661细胞中对BRD4的DC50值为200 nM。在SNIPER技术的帮助下报告了PROTAC 162（图30）。162能够加速BET、cIAP和XIAP的消耗。有趣的是，XIAP和BRD4的降解需要三元配合物的形成，而cIAP的降解只需要cIAP与162的结合和自泛素化。以7（图4）作为CRBN配体，在22Rv1细胞（DC50 = 0.32 nM）中挖掘出PROTAC 163（图30）作为对BRD4的高效PROTAC。此外，以BET为靶点的PROTAC 164（图30）和165（图30）也被报道为有效的降解剂。

图30 靶向BET蛋白的PROTACs

ABPP是功能蛋白质组学的一种策略。2019年，基于ABPP平台获得了28个基于ABPP平台的新型RNF4 E3连接酶亲电配体（表1）。然后，将28与JQ1连接，得到了能够诱导BRD4降解的PROTAC 166（图30）。26（表1）是通过ABPP筛选出的DCAF16 E3连接酶的亲电配体，可用于发现有效的BRD4靶向PROTAC 167（图30）。通过模拟29与RNF114的结合模式，利用了共价的RNF114配体EN219（表1）。EN219被证明可以作为RNF114配体，发现PROTAC 168（图30），对BRD4降解具有纳摩尔降解活性。

β-萘黄酮是芳基烃受体E3连接酶的配体。β-萘黄酮可以用来合成PROTAC 169（图30），它能够促进BET的降解。

三价PROTAC 170（图30）是通过分支连接体将两个JQ1分子与VHL配体结合而合成的。170对BET蛋白表现出皮摩尔降解活性，并比二价PROTACs表现出更持久和更高的降解效果。根据机理研究，170个与BRD4和VHL的BD1和BD2串联形成1：1：1的三元配合物。此研究为开发三价PROTACs奠定了实际基础。

（2）靶向B细胞淋巴瘤2（BCL-2）家族的PROTACs：BCL-2基因家族编码20多个调节细胞凋亡的蛋白。在这些成员中，抗凋亡蛋白包括BCL-2、BCL-XL和MCL-1被证明是癌症治疗的关键靶点。

ABT263是一种双BCL-2/BCL-XL抑制剂。利用ABT263在MOLT-4细胞中发现了有效的BCL-XL降解剂171（DT2216，图31），该细胞的DC50值为63nM，Dmax值为90.8%。171能显著抑制MOLT-4细胞的增殖，优于其亲本化合物ABT263。与BCL-2、BCL-W和MCL-1相比，171对BCL-XL的选择性更高。在MOLT-4细胞T-ALL小鼠异种移植模型中，每周腹腔注射15mg/kg，171可完全阻止肿瘤生长。重要的是，171已进入I期临床试验。CRBN-招募的PROTAC 172（图31）在WI38非衰老细胞（DC50 = 46 nM）和衰老细胞（DC50 = 44 nM）中作为选择性BCL-XL降解剂。此外，172可以有效地清除自然衰老小鼠的衰老细胞，而不会导致血小板减少，说明其毒性低于ABT263。

图31靶向BCL-2家族的PROTACs

双BCL-2/MCL-1抑制剂Nap-1衍生的PROTACs仅仅通过不同的连接子就能达到高选择性。因此，PROTAC 173和174（图31）可以分别特异性地促使MCL-1（DC50 = 700 nM）和BCL-2（DC50 = 3000 nM）的耗竭。结果证实，PROTAC触发了三元配合物的形成，并使蛋白质被蛋白酶体降解。基于BCL-XL选择性抑制剂A-1155463的PROTAC 175（图31），在THP-1细胞（DC50 = 4.8 nM）中对BCL-XL具有良好的降解活性。通过解析VCB：175：BCL-XL的共晶结构，明确了175与BCL-XL的结合模式。基于MCL-1抑制剂a-1210477的PROTAC 176（图31）也被发现是一种有效的MCL-1降解剂。

（3）靶向组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的PROTACs：HDACs负责调节组蛋白和非组蛋白乙酰化水平，作为重要的抗肿瘤靶点。HDAC6是被研究最多的HDAC成员之一。PROTAC 177在MCF-7细胞中作为一种有效的HDAC6降解剂，DC50值为34 nM，而其他成员（HDAC1、HDAC2和HDAC4）几乎完好无损。为了解决177的不稳定性，他们用选择性HDAC6抑制剂A替换了177的HDAC配体，最终筛选出PROTAC 178（图32）。结果表明，178能显著诱导HDAC6（DC50 = 1.64 nM）的降解，并抑制MM1S细胞系的增殖。此外，178降低了IKZFs的水平。随后，建立了含有末端醛基的来那度胺类似物库，最终获得了179个（YZ065，图32）和180个（YZ090，图32），与CRBN具有较高的结合亲和力。然后，分别以179和180作为CRBN配体构建PROTAC 181（图32）和182（图32）。181和182在降解活性方面与178相当，对HDAC6也保持了高选择性。同时， MM1S（DC50 = 7.1 nM）和小鼠4935（DC50=4.3nM）细胞对HDAC6具有纳摩尔降解活性的VHL招募PROTAC 183。

图32 针对HDAC的PROTACs

HDAC6抑制剂以nexturastat A为基础的PROTAC 184（图33）能够加速HDAC6在MM1S细胞中的快速降解，DC50值为3.8 nM。随后，进一步优化184的结构，得到了PROTAC 185（图33），显示了MM1S细胞中DC50=3.2nM与184相似)和对HDAC6的高选择性。将HDAC抑制剂SAHA与抑素连接生成PROTAC 186（图33），在4 nM浓度下显著降低了HDAC1、HDAC6和HDAC8的水平。

图33 靶向HDACs的PROTACs

除HDAC6外，靶向HDAC3的PROTACs也被深入挖掘。2020年，Liao团队使用I型HDACs抑制剂SR-3558作为HDACs结合弹头合成了VHL招募的PROTAC 187（图33）。在187的存在下，MDA-MB-468细胞中HDAC3（DC50 = 42 nM）的水平显著下降，而HDAC1、HDAC2和HDAC6的水平基本保持不变。此外，187足以抑制乳腺癌细胞系T47D、MDA-MB-468、HCC1143和BT549的集落形成和生长。在RAW264.7巨噬细胞中，在CI994增加一个氟原子可以提高对HDAC3的选择性，DC50值为320 nM。PROTAC 189（图33）在1000 nM浓度下能显著诱导HDAC1、HDAC2和HDAC3的降解，而在较低浓度下对HDAC1表现出较好的选择性。

（4）靶向SHP2的PROTACs：SHP2是一种由PTPN1基因编码的磷酸酶，作为T细胞激活的调节因子和许多信号通路，包括RAS-ERK、PI3K- AKT和JAK-STAT。

PROTAC 190（图34）是KYSE520（DC50 = 6.0 nM）和MV4；11（DC50=2.6nM）细胞中对SHP2最有效的降解剂。此外，190能够有效抑制KYSE520（半抑制浓度= 660 nM）和MV4；11（9.9nM）细胞系的增殖，并降低ERK磷酸化水平。基于SHP2变构抑制剂TNO155的CRBN-招募PROTAC 191（图34）。191被证实可以促进CRBN依赖的SHP2（DC50 = 6.02 nM在MV4；11细胞中）的降解。从SHP2变构抑制剂RMC-4550中提取的CRBN-招募的PROTAC 192。192在浓度低至10 nM时有效，特异性高。此外，192被证明可以抑制MAPK信号通路，抑制KYSE-520和MV4；11细胞系的生长，与其亲本化合物RMC-4550相当。SHP2抑制剂SHP099衍生的PROTAC 193是一种具有纳摩尔降解活性的活性SHP2降解剂。Hela细胞系对193（半抑制浓度= 5.77 nM）的反应明显高于对亲本化合物SHP099（IC50= 566.12 nM）。此外，193可降低磷酸化的JNK、ERK和p38的水平。

图34 靶向SHP2的PROTAC

（5）靶向KRAS的PROTACs：KRAS是一种由kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源基因（KRAS）基因编码的GTPase，在癌症中经常发生突变。一些KRAS突变导致其持续激活，导致肿瘤发生和进展。传统上，KRAS被认为是一个不可用药的靶点，因为缺乏传统的药物结合袋和与GTP的异常高的结合亲和力的靶点，因此开发小分子抑制剂具有挑战性。随着PROTAC技术的出现，这个棘手的问题有可能会得到解决。

在NSCLC患者中，所有KRAS突变体中KRASG12C的比例高达45%-50%。波马利度胺与含喹唑啉的化合物结合合成的PROTAC 194（图35），该化合物能够结合到KRAS的II区域。194被证明可以有效诱导GFP- KRASG12C和CRBN二聚，促进GFP- KRASG12C融合蛋白的耗尽，而不影响内源性KRASG12C。大部分内源性KRASG12C位于质膜和线粒体中，而不是位于细胞质中。此外，内源性KRAS上的赖氨酸可能无法用于泛素偶联，而且在体外没有发生多泛素化。因此，内源性KRASG12C没有反应。

为使内源性KRASG12C进行降解，合成了VHL-招募的PROTAC 195（图35），195在H2030细胞（DC50 = 590 nM）和其他几种肿瘤细胞中对KRASG12C有效。此外，195可显著抑制ERK的磷酸化。表3列出了针对其他蛋白的PROTACs。

表3 靶向其他蛋白质的PROTACs

06

HaloPROTACs研究进展

HaloTag（HT）是一种改良的卤代烷烃脱卤酶，可以从脂肪族碳氢化合物中脱掉卤化物。在催化过程中，酶中的天冬氨酸与碳氢底物之间形成共价酯键。一般来说，HaloPROTAC是一种双功能分子，由能够与HT共价结合的氯烷烃链基团和E3配体基团组成。与HalT和E3结合后，HaloPROTAC将加速HT与靶蛋白融合的泛素化和随后的蛋白降解（图36）。

图36 HaloPROTAC的作用模式

使用VHL配体作为E3弹头合成了HaloPROTAC236（图37）。236在HEK293细胞（DC50 = 19 nM）中对GFP-HT7融合蛋白表现出较强的降解活性。该降解过程被证实是VHL和蛋白酶体依赖性的。236还完成了其他融合蛋白的降解，包括ERK1-HT7和MEK1-HT7。使用优化的VHL配体HaloPROTAC237（图37）。237诱导了HEK293细胞中Halo- VPS34和Halo-SGK3融合蛋白的特异性降解，DC50值在3~10nM之间。与236相比，237对Halo-VPS34表现出更强的降解活性。

图37 HaloPROTACs的结构。

07

dTAG系统研究进展

dTAG系统由Bradner团队于2018年创建。一般来说，将POI与F36V突变的fk506结合蛋白-12融合（FKBP12F36V），所得到的融合蛋白被FKBP12F36V靶向的PROTACs降解（图38），实现POI降解（图38）。

图38 dTAG技术示图

以FKBP12为靶点的PROTACs 238（图39）和239（图39）能够加速293FT细胞中FKBP12f36v-纳米荧光素酶（Nluc）融合蛋白的降解，而野生型FKBP12（FKBP12WT）的水平不受影响。为了验证该系统的实用性，238和239分别在构建的融合蛋白如FKBP12F36V-BRD4、FKBP12F36V-KRASG12V、BRD4-FKBP12F36V、HDAC1-FKBP12F36V、MYCFKBP-FKBP12F36V、PLK1-FKBP12F36V进行测试。结果表明，238和239在MV4和11细胞中对这些融合蛋白表现出纳摩尔降解活性。重要的是，238可以显著促进小鼠luc-FKBP12F36V的消耗。将VHL-招募的PROTAC 240（图39）描述为抗FKBP12F36V-KRASG12V和FKBP12F36V-EWS/FLI的有效降解剂。

图39 靶向FKBP12F36V的PROTACs

08

AdPROM系统研究进展

AdPROM系统于2016年发明。配体诱导的AdPROM（L-AdPROM）系统，如图40a所示。通过将HT与抗原稳定的突变体GFP抗体（aGFP6M）和FLAG标记物融合，构建了FLAG- aGFP6M-Halo蛋白。FLAG-aGFP6M- Halo可以识别并结合GFP-POI融合蛋白。因此，以HT为靶点的PROTAC 237（图40b）诱导FLAG-aGFP6M-Halo：GFP-POI复合物的泛素化，然后通过蛋白酶体降解。在这种情况下，aGFP6M在与GFP结合时是稳定的，在未结合时是降解，这保证了FLAG-aGFP6M-Halo与GFP-POI的比例为1：1。L-AdPROM系统成功扩展到GFP-UNC-51样激酶1（ULK1），序列相似性83成员D（FAM83D）-GFP和血清和糖皮质激素调节蛋白激酶3（SGK3）-GFP。

图40 L- AdPROM系统

（a）L-AdPROM系统的作用机制（b）237的化学结构（HaloPROTAC-E）。

为了在不构建GFP-HRAS融合蛋白的情况下实现内源性HRAS和KRAS的降解，我们表达了与HRAS抗体融合HRAS标记的HT，即FLAG-Halo- aHRAS。在237存在的情况下，内源性RAS被有效降解。

尽管AdPROM和dTAG系统具有广泛的目标适用性，但对基因操作的要求限制了它们的发展。

09

靶向蛋白解的其他技术

（1）溶酶体靶向降解嵌合体（LYTAC）和基于抗体的PROTAC(AbTAC)：PROTAC需要招募细胞内的E3连接酶，使POI被泛素化和降解。因此，PROTAC必须穿过细胞膜进入细胞，才可以达到将蛋白降解的目的。因此，可降解的POI在很大程度上局限于具有细胞内配体结合区的细胞蛋白，而细胞外POI或没有细胞内配体连接区的细胞POI是不可被降解的。此外，由于分子量高，溶解度差，PROTAC难以穿透细胞膜。LYTAC和AbTAC是一种具有细胞外功能作用的双功能分子，可用于处理细胞外POI或一些难以透膜POI。

LYTAC：LYTAC的概念是由Bertozzi于2020年提出。LYTAC是一种双功能分子，由与POI结合的抗体或小分子配体和与非阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）结合的糖多肽组成。CI-M6PR作为一种转运体，负责将带有甘露糖-6-磷酸（M6P）残基覆盖的n-聚糖的蛋白质运输到溶酶体。POI：LYTAC：CI-M6PR形成后，三元配合物通过内化被转运到溶酶体中进行POI降解，而CI-M6PR可以被循环利用（图41）。

图41 LYTAC的作用机制

poly（M6Pn-co-Ala）（或称为poly（M6Pn），图42）与山羊抗小鼠免疫球蛋白G连接起来，生成Ab-1（图42）。当细胞与Ab-1、mCherry和小鼠抗mCherry共孵育时，观察到mCherry的摄取增加。同样，Ab-1也可以加速载脂蛋白E4（ApoE4）和转铁蛋白受体-1（CD17）在溶酶体中富集并进行降解。

图42 Ab-1的结构及其合成工艺

EGFR靶点也受到了关注。因此，将西妥昔单抗与poly（M6Pn）偶联产生Ab-2，在浓度低至10 nM时，能够促进溶酶体和ci-m6pr依赖的方式对EGFR降解。类似地，PD-L1抗体衍生的Ab-3能够加速PD-L1的消耗。

基于抗体的PROTAC(AbTAC)：AbTAC可在细胞外诱导膜蛋白的降解。AbTAC是一种重组双特异性抗体，可同时结合到细胞膜POI和E3连接酶的胞外区域。三元配合物的形成导致其内化和溶酶体降解（图43）。重组双特异性抗体Ac-1，可在MDA-MB-231细胞中结合跨膜RNF43 E3连接酶和PD-L1。因此，在MDA-MB- 231细胞以及其他肿瘤细胞（HCC827和T24）中，Ac-1以RNF43-和溶酶体依赖的方式显著降低了PD-L1的水平。

图43 AbTAC的作用机制

细胞外TPD扩大了可降解的靶点范围。然而，含抗体的分子仍然存在不稳定性和潜在的免疫原性。体内活性尚不清楚。还需要作出更多的努力来进一步验证其实用性。

（2）自噬靶向嵌合体(AUTAC)和自噬-栓系复合物(ATTEC)：自噬-溶酶体系统是降解受损或废弃细胞成分的另一个重要途径，在细胞内稳态起着关键作用。根据载体转移到溶酶体的方式，自噬分为巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。巨自噬是自噬的主要类型，是指双膜吞噬细胞成分，自噬体与溶酶体融合降解物质。与UPS相比，自噬可以致更广泛的细胞成分，包括细胞器、致病蛋白、蛋白质聚集物和核酸被降解。AUTAC和ATTEC劫持巨自噬，实现POI的消耗。

自噬靶向嵌合体(AUTAC)：AUTAC由Arimoto于2019年发明，由POI配体、环鸟苷（cGMP）或其类似物部分和连接体组成。在与AUTAC结合后，POI将被自噬标签cGMP或其类似物标记，并被自噬-溶酶体系统降解。

K63连接的多泛素化在自噬降解细胞质a型链球菌（GAS）的过程中起着关键作用。GAS的s-鸟苷化与其多泛素化密切相关。因此，Arimoto假设cGMP标记的蛋白倾向于被自噬多泛素化和降解（图44）。通过将cGMP与能够与HT共价结合的氯烷烃连接，合成了AUTAC 241（图45）。241在10000nM浓度下可诱导Hela细胞中EGFP-HT融合蛋白的溶酶体降解。这一过程证实与微管相关蛋白1A/1B轻链3B（LC3）、p62和自噬相关基因（Atg5）相关，表明EGFP-HT被自噬降解。

图44 AUTAC的动作模式

图45 靶向不同POIs类型的AUTAC

进一步优化cGMP以提供对氟苄基鸟嘌呤（FBnG），用于合成FBnG衍生的AUTAC 242（图45），以加速AUTAC与EGFP‐HT的反应，并避免cGMP依赖性蛋白激酶G激活引起的潜在副作用。242被证实能够促进EGFP- HT的降解。为了验证该策略的实用性，分别基于MetAP2、FKBP12和BET配体生成了AUTACs 243、244和245（图45）。这些化合物分别能有效地诱导MetAP2、FKBP12和BET的降解。为了探讨AUTAC对线粒体吞噬的影响，将能够与线粒体结合的2-苯乙烯类似物与FBnG偶联，生成246（图45）。研究表明，246可以促进Detroit 532号21三体细胞的线粒体自噬，加速线粒体的再生，从而提高线粒体的功能。证实AUTAC促使k63泛素化。然而，多聚泛素链附着在载体上的确切机制仍不清楚。

ATTEC：ATTEC能够通过自噬诱导POI降解（图46）。

图46 ATTEC的动作模式

LC3是一种自噬小体相关蛋白，当自噬小体延长时，从（LC3-I）转化为LC3-II。LC3-II被整合在吞噬体中，作为自噬受体，负责与泛素化底物结合的适配器蛋白结合。一个能够同时参与突变的mHTT蛋白和LC3的小分子能够将mHTT“拖到”自噬小体中，通过自噬降解（图46）。247和248（图47）被证明可以加速HD敲除小鼠模型中初级皮层神经元中mHTT的降解。247和248具有内酰胺基双环结构和卤素取代芳基，证实能够与LC3和mHTT相互作用。在247和248的结构基础上，一步筛选出了249和250个（图47），它们对mHTT也有效，而野生型HTT保持完整。

图47 靶向mHTT的ATTECs

尽管ATTEC取得了成就，但它们与LC3的作用模式仍不清楚。对动作模式的阐明有助于合理设计ATTEC。此外，LC3配体也可用于设计双功能化合物，利用自噬-溶酶体系统诱导POI降解。

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分子胶研究进展

分子胶是一种蛋白-蛋白相互作用（PPI）稳定剂，它能够与蛋白质结合，使其能够与新底物相互作用。

环孢素A（CsA）是一种免疫抑制剂，具有分子胶的作用。CsA可诱导亲环素和钙调神经磷酸酶之间的PPI抑制钙调神经磷酸酶，降低T细胞活性。雷帕霉素，另一种分子胶，于1999年被FDA批准用于预防患者的器官排斥反应。雷帕霉素可与FKBP12结合形成fkbp12-雷帕霉素复合物，该复合物与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）相互作用，发挥其免疫抑制功能。IMiDs（图4）当与CRBN结合时，可以降低IKZF1/3和酪蛋白激酶1（CK1α）的水平。从沙利度胺与CRBN的共晶结构可以看出（图4），戊二酰亚胺基团延伸到三种色氨酸定义的口袋中，而邻苯二甲酰亚胺则面向溶剂区域，调节与底物的相互作用。对来那度胺进行修饰得到了6（图4），可以诱导一种新的底物GSPT1的降解，说明在分子胶上的结构修饰可以改变底物的范围。植物激素生长素是一种分子胶，能够诱导SCFTIR1 E3连接酶与生长素/indole-3-乙酸（Aux/IAA）相互作用，降解Aux/IAA，调节植物的生长。磺胺类抗肿瘤药物251-254（图48）发挥了分子胶的作用，与DCAF15结合，促进剪接因子RBM39的降解。

图48 报道分子胶

基于对肿瘤细胞系的药物敏感性和与E3连接酶信使RNA的相关性，从临床和临床前药物库中筛选出与适配体蛋白DDB1相关的CDK12抑制剂257（CR8，图48）能够在不需要底物受体的情况下诱导CDK12-细胞周期蛋白K与CUL4-RBX1-DDB1的相互作用，诱导细胞周期蛋白K的降解。复合物CDK12-cyclin K：257：DDB1的共晶结构（图49）表明，（吡啶-2-yl）苯基在稳定DDB1与CDK12之间的相互作用中起到了至关重要的作用（图49b）。

图49 257（CR8）诱导的细胞周期蛋白K泛素化

（a）257对细胞周期素K泛素化的作用模式（b）257与DDB1和CDK12的结合模式

258和259（图48）作为cyclin K和RBM39的降解物。从机制研究中看出，259结合到CDK12的催化区域，诱导不需要底物受体的CDK12和DDB1相互作用，而258加速了底物受体DCAF15中RBM39的耗尽，这与磺胺类化合物251-254一致。

分子胶在细胞通透性和药代动力学特性方面似乎优于PROTAC，使其成为一种很有前途的临床应用降解剂。然而，天然的分子胶稀少，其结构生物学、分子机制和结构活性关系特征较差，分子胶的合理设计充满了挑战。

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PROTACs诱导的光控蛋白降解

PROTAC主要有两种类型。一种类型是具有光可裂解保护基团的光响应脱笼PROTACs，它采用光敏性基团先遮挡分子的活性部位;当分子转运到特定部位和组织中再采用光照切断光敏性基团恢复PROTACs的活性,开启靶蛋白的降解。另一种是具有光敏基团的可光切换PROTACs，其构象可以通过光刺激改变，使PRTOACs在活性和非活性构象之间转换。

（1）光响应脱笼PROTACs：邻硝基苄基经常用于光笼PROTACs。将保护基团4,5-二甲氧基-2-硝基苄基连接到靶向BRD4的PROTAC 153上（图50），得到了不活跃的光笼化PROTAC 260（图50）。在365 nm的光刺激3 min后，可以快速去除定向基团，所得到的活性PROTAC 153有效地诱导了BRD4的降解。此外，在260存在的情况下，在斑马鱼胚胎中也可以实现BRD4的光控制降解。

图50 光笼中的PROTAC 260通过光转化为有源的PROTAC 153。

同样，来自BTK降解剂48（图11）的光笼化PROTAC 261（图51）也被证明在光刺激下能有效诱导BTK的降解。根据保护基团4,5-二甲氧基-2-硝基苄基，报道了靶向BET和ALK的光笼PROTAC 262和263（图51）。在VHL配体上的羟基上附着一个庞大的基团可以阻断与VHL的结合，从而使羟基成为光裂解基团修饰的理想位置。将4,5-二甲氧基-2-硝基苄基结合到VHL配体上，合成光笼化PROTAC 264（图51）。在365 nm光刺激下，保护基团被快速裂解，释放活性PROTAC，降解BRD4。此外，采用二乙基香豆素（DEACM）和6-硝基哌酰基羟甲基（NPOM）作为保护基团，发现了光笼PROTAC 265和266（图51），分别诱导了ERRα和BRD4的降解。

图51 光笼中PROTACs（photocaged PROTACs）的结构。

（2）光响应开关型PROTACs(photoswitchable PROTACs)：功能偶氮苯经常被用作光开关，因为它在受到光刺激时可以在反式和顺式构象之间转换。将四氟偶氮苯部分偶联到连接剂上，可得光切换的PROTAC 267（图52）。在530 nm光照射下，活性反式-267可转化为非活性顺式-267。顺式-267被证明不能诱导BRD2的降解，因为连接子距离较短（8 A，图52）不有利于三元配合物的形成。重要的是，与光笼中的PROTACs不同，这种光刺激的构象转换是可逆的。对BRD2的降解活性可以通过415 nm光的刺激来逆转，使顺式-267转化回活性的trans-267（图52）。

图52 光开关267的反式和顺式构象之间的转换

BET靶向的光切换PROTAC 268（图53）。与267相比，顺式-268是活性构象，可以加速BRD2、BRD3和BRD4的耗竭。顺式268可以在无光条件下缓慢转化为trans-268，或在525nm光条件下快速转化为trans-268，恢复BET水平。利用光开关PROTAC 269对FKBP12的可逆光控制降解（图53）。紫外光可以将270转化为非活性的顺式-270，而可见光可以将顺式-270转化为反式-270。

图53 光切换PROTACs的结构及其构象的相互转换。

蛋白质降解的时空控制被认为是一种革命性的策略，以实现体内的组织选择性和降低PROTACs的潜在毒性。光笼和可光开关PROTACs也存在一些限制。光敏部分的掺入提高了PROTAC的分子量。此外，偶氮苯在体内也可能是不稳定的。此外，光引起的组织损伤也不容忽视。这些缺点需要耐心解决，以扩大光控制PROTAC的效用。

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疏水标记技术研究进展

疏水标签可以模仿部分错误折叠的蛋白，它可以被伴侣识别并进行蛋白酶体降解。因此，用含高脂肪的标签标记POI将是治疗TPD的有效方法。

富维司特（图54）是一种选择性雌激素受体下调调节剂（SERD）。根据作用模式，富维司特的疏水链被认为模拟部分变性的内质网，这导致内质网降解。为了提高氟维司特的口服生物利用度，引入了一个硼酸基团发现了SERD 272（图54）。272可诱导T47D细胞中ERα的降解，DC50值为7.8 nM。根据内质网配体，将一系列疏水部分连接到内质网配体上，筛选出273（图54）作为抗ERα的高效SERD（DC50=0.4nM）。

图54 疏水部分标记的小分子

除富维司特中的脂肪链外，金刚烷基也经常被用作POI降解的标签。将金刚烷基与HT配体结合，合成了274个（图54），对血凝素（HA）、增强绿色荧光蛋白（EGFP）和HT融合蛋白（HA-EGFP-HT）表现出纳摩尔降解活性。值得注意的是，跨膜融合蛋白包括Ror2-HA-HT、CD3E-HA-HT、CD9-HA-HT、GPR40-HA-HT和Frizzled-4-HA-HT可被蛋白酶体降解。含金刚烷的275（图54）是一种有效的AR降解剂，在LNCaP细胞中对AR具有微摩尔活性。同时，基于共价HER3抑制剂，276（图54）可以促进HER3的降解。将PLK1抑制剂与金刚烷基结合生成277（图54），在50000nM浓度下能够显著加速PLK1的消耗。此外，277被证明可以提高Hela细胞的凋亡率，比其亲本化合物Poloxin-2更有效。使用AR拮抗剂RU59063作为AR配体，在点击化学的帮助下，产生了一些选择性雄激素受体下调调节剂。最终，278（图54）为一种有效的具有微摩尔活性的AR降解剂。同时也证实了278能诱导LNCaP细胞轻度凋亡，并将细胞周期抑制在G0/G1期。

Boc3Arg也能作为TPD的疏水标记。279和280（图54）被证明能够在非常高的浓度下分别诱导谷胱甘肽-s-转移酶α1和二氢叶酸还原酶的降解。Boc3Arg增强的降解依赖于蛋白酶体，而不需要泛素化。

疏水标记技术扩展了TPD的应用范围。可以被PROTACs降解的目标可以通过疏水标记的小分子来解决。然而，强疏水性导致的溶解性和渗透性较差，往往限制了这些降解剂的生物活性。

Zhao HY, Xin M, Zhang SQ. Progress of small molecules for targeted protein degradation: PROTACs and other technologies.

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Hanan EJ, Liang J, Wang X, Blake RA, Blaquiere N, Staben ST. Monomeric Targeted Protein Degraders. J Med Chem.

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