整合XCell ATF和单柱层析的连续生物工艺：提高protein A填料利用率和产物产量
本文为《Integrated continuous biomanufacturing platform with ATF perfusion and one column chromatography operation for optimum resin utilization and productivity》内容简介，详细内容，请参考原文。
文章介绍了一种用于抗体连续生产的新型整合式连续生物生产平台，平台采用固定的培养体积和细胞密度，以延长生产持续时间，同时产物即时捕获。抗体上游生产技术已趋成熟，现在，连续生物生产的瓶颈在于初步层析步骤中如何高效且经济地捕获治疗性抗体。在本研究中，实验成功地尝试了使用单柱连续层析（OCC）用于连续捕获以交替式切向流（ATF）灌流生产的治疗性抗体。通过上游培养基优化，上游灌流速率减少到每天一个罐体积（1 VVD），提高了抗体滴度，并减少了灌流液的体积。此外，通过工艺优化，使产量比之前报告的值提高了80%。同时，研究提出了一种用于实时评估柱效的方法，以执行层析柱切换的决策。相比多柱系统，更高的产量结合单柱系统的使用，使工艺监测和控制更为优化。该方法为治疗性蛋白的生产提供了一种经济高效且灵活的平台工艺。
简介
在设备占地、批次间一致性、提高产量和降低资本投入等方面，连续生产相比批次工艺具有显著的优势。但尽管有这些优势，生物技术行业改变传统批次和补料分批工艺的进展却相对缓慢，主要因为担心复杂性的增加以及严格的监管，可能会导致生产中断。这就解释了为什么近几十年来，尽管技术有了相当大的进步，但行业整体的变化却较小。
在不久的将来，由于不断发展的商业环境、对一次性使用系统重燃的兴趣以及多样的监管环境，治疗性抗体厂商必须采取重大的改变，以控制成本，实现灵活性，保持一致的产品质量，且产能必须更容易调整，以适应快速且频繁变化的全球供给和需求环境。一种方法是开发具有成本效益的平台工艺，以用于不同治疗性蛋白的生产和捕获。
从历史上看，连续细胞培养已经被用于治疗性蛋白的生产，特别是用于生产不稳定的产品，如Cerezyme®（Genzyme）和Kogenate®（Bayer），在这些情况中，使用连续细胞培养的动机是为了应对治疗性蛋白的高度不稳定性。这些不稳定的产品从连续培养中收获并去除，以防止降解。将这些连续的上游工艺与连续的下游工艺相结合，可形成一个完全整合的连续生物生产系统，但目前还没有在大规模商业化生产中实现。
制药行业的连续纯化由使用六根层析柱的模拟移动床技术开创，并由ChromaCon®发展成为双柱系统。下图总结了一些关于连续纯化发展的例子。最近，上、下游工艺整合方面的进展形成了由连续上游和多柱连续下游工艺相结合的系统。其中的例子包括四到六柱的模拟移动床（SMB）、四柱的顺序多柱层析（SMCC），三柱的周期性逆流层析（PCC）以及两柱的双柱层析。
连续纯化中层析柱数量的演变。目前的单柱层析方法比行业预测提前5年。
采用多柱方法一般与每天3到5个罐体积的更高灌注速率有关。通过采用创新的培养基配方，目前的方法已经优化到一天一个罐体积，同时保持营养物和代谢废物受控。仅这一项优化就可使培养基用量减少数倍（细胞培养基约70美元/升）。上游更低的灌流速率可降低灌流物料体积，并提高抗体浓度。也就是说，下游操作只需要更少的纯化循环和更小的柱尺寸，从而节省上游和下游的成本。
在本研究中，成功地执行了由灌流培养和OCC组成的整合式连续生物生产平台，并用于生产具有一致产品质量的治疗性抗体。通过工艺和培养基优化策略，灌流速率与纯化速率匹配。关键的工艺优化在于：优化了灌流参数，以降低培养基使用（这是细胞培养中一个重要的成本动因），且因为灌流速率的降低，获得了具有更高抗体浓度的灌流液，同时通过降低流速，优化了填料动态结合载量的利用，使Protein A的用量降低了20倍。此外，单柱下游捕获步骤的使用在技术上非常实用，与SMB、SMCC和PCC等其它技术相比，其在具有不同厂房和设备配置的公司中，可以非常容易地实现。
用于1kg 亲和纯化抗体生产的OCC方法 vs 传统补料分批。
可能有人会认为OCC方法中提出的非连续上样是不连续的。然而，如下图所示，即使是循环连续的多柱系统也是在单柱水平上进行处理的。使用多柱操作的理由是其可提高生产率，也可以作为处理连续细胞培养高流量流出液的方法。此外，即使是多柱操作，在工艺中断（如更换层析柱）期间，仍需要储罐作为缓冲。使用多根下游层析柱会增加工艺的复杂性、设备成本和失败几率。
PCC和OCC工作操作的比较。亲和层析中，捕获-洗脱的特性，在两种情况中均可实现循环连续工艺。层析柱的数量用于确保生物反应器流出液的及时处理。
本文提出的OCC试图通过消除对多柱的需求来解决这些问题。为了实现这一目标，将上游工艺优化（降低灌流速率）和下游工艺提升（提高生产效率）相结合，开发了一种简单、稳健且灵活的整合式上游灌流/单柱下游工艺，用于生产治疗性抗体。
材料和方法
细胞培养：灌流模式细胞培养在3L玻璃生物反应器内进行，使用2L工作体积，反应器配置XCell ATF 2系统及膜表面积1000cm2、孔径0.2μm的中空纤维过滤器（Repligen）。溶氧以O2鼓泡控制。细胞密度、营养物和代谢废物使用NOVA Bioanalyzer 400（Nova Biomeidcal）离线检测。通过内部实验，对化学限定培养基进行优化，以提高生物反应器性能。实验使用可生产生物仿制药的专利CHO细胞系。细胞以0.5 x 10^6 cells/mL接种。通过灌流速率的调节，控制细胞生长、乳酸和氨的生产，营养物水平使用含有额外营养物的浓缩培养液控制。工艺经优化，以达到1个罐体积每天（1 VVD）的平均灌流速率。pH使用碳酸氢钠和CO2气体控制为约7.2。溶氧控制>40%。收获液直接上样至单根MabSelect Protein A层析柱（Cytiva），不进行额外的澄清。
下游：抗体捕获使用5mL MabSelect预装层析柱，其连接至Quantasep100单元（Sepragen）。每个纯化循环由平衡、上样、漂洗、洗脱和再生步骤组成。虽然研究中设置不提供无菌操作，但Sepragen现在提供使用一次性使用管路的相同单元，其可实现无菌操作。这一功能在cGMP生产过程中非常实用。
方法同步：使用2L生物反应器，在抗体产生阶段，灌流速率优化为1 VVD，对应每24 hr产生2000 mL的流出培养液。单柱操作优化为35 min，每个循环上样50 mL灌流液。每20个循环后，进行20min的清洗/消毒循环。这可在每24 hr内进行40个完整的循环或每24 hr处理2000 mL灌流液，与灌流速率相当。灌流速率与抗体捕获速率同步，同时可维持所需的葡萄糖和乳酸水平。
分析方法：请参考原文。
OCC方法：单个protein A循环包括平衡、上样、漂洗和洗脱等步骤。当进行漂洗、洗脱和平衡步骤时，在缓冲容器中积累的灌流液量足以完成一个层析循环上样步骤的需要。实际上，上样量比灌流收获量略大：在持续35 min的每个循环中，从反应器中流出48.6 ml的收获液，但有50 ml灌流液上样至层析柱。所以，每进行20个循环（700 min），有一个持续20 min的消毒/再生步骤，额外所需的灌流液在这个消毒/再生步骤中累积，弥补了每个纯化循环中缺少的额外物料。
在未来的工艺优化方法中，每个循环之间，缓冲容器中的物料量可以最小化到接近零。然而，在实际操作中，还是使用了一个1 L的缓冲瓶，其中含有大约200 mL的物料，因为该工艺不能过夜监控。选择200 mL的体积是为了确保对输入的物料进行适当的混合，以避免随着时间的推移出现“旧”的灌流液，这可能会导致抗体降解和/或聚集，污染汇合的样品，而要求在下游工艺中进行额外的纯化操作。这个较大的缓冲瓶也是为了在纯化系统可能出现的夜间停机状况下提供一个缓冲。
这种方法的独特之处在于与上游灌流速率的完美同步。单个层析循环优化为35 min，而上样流速仅为其它步骤的一半。低上样流速可将动态结合载量提高到非常接近静态结合载量的水平，这一特点对于未来灌流细胞培养的工艺优化将非常有帮助，因为生物反应器滴度可能还会不断提升。
OCC中的工艺步骤原理图。纯化以储瓶中大约20 mL的灌流液开始。该循环在上样（L）循环结束以及一个漂洗（W）循环开始时开始。漂洗循环以10个柱体积完成，持续10min（储瓶中收集13.9 mL）。洗后用，以5个柱体积洗脱5 min（收集总灌流液20.8 mL）。平衡步骤另需10个柱体积，持续10 min（储瓶中总共收集34.7 mL）。上样步骤需要10 min，上样50 mL灌流液（总共收集13.9+ 34.7 ml = 48.6 ml）。在每20个循环进行一次的20 min消毒步骤中，对过量的灌流上样进行补偿。
更低的Protein A用量：与SMB和PCC相比，OCC方法的关键特点是使用单根protein A层析柱。例如，超过30天的灌流将产生1000 L的培养液，这里最多只需要1 L protein A，而批次和补料分批至少需要200 L protein A。这意味着仅protein A填料就可以节省200倍（Protein A填料约为$75,000/L）。这就有可能减低层析柱尺寸并运行多个循环。而如果使用相同的1 L填料，处理OCC方法中获得的1000 L体积，以相同的填料载量计算，在批次或补料分批工艺结束时，总共大约需要60到100个循环。这可能会使整个工艺时间增加数周，并导致产品放行严重推迟。
工厂灵活性：文章提出的OCC平台为不同规模和设备配置的公司提供了显著的灵活性。执行SMB或PCC需要购置新的昂贵设备，这对小公司来说，会是不小的经济负担。除了设备成本之外，还需要对厂房进行大量的改造，以便更充分地使用这些新设备。而本研究提出的方法只需要很少或不需要对工厂进行调整。但当然，需要对工艺有详细的了解，这可能需要一定的工艺开发和优化工作。
工艺监测：该方法简化了准确监测柱效和做出层析柱切换决策的过程。在SMB和PCC中，会使用多根层析柱，每根层析柱都需要连续监测。即使使用了多元统计，这也会很麻烦。行业实践包括使用理论塔板的脉冲输入高度当量（HETP），以及由经培训的人员对关键参数进行监测，如步骤产量以及层析数据的定性审阅。脉冲输入HETP在整合式连续生物生产中的缺点是，它需要停止工艺，以进行检测。这在实际操作中不太可行，因为完美的液流同步最终将导致工艺错配。此外，过度依赖于厂商提供的循环数可能也不太可靠，且不能贴合质量源于设计（QbD）和过程分析技术（PAT）的原则。在OCC中，使用单根层析柱可确保开发详细的层析柱监控机制，提供有关柱效和寿命周期的详细信息，以确保准确的层析柱切换决策。在未来的报道中，作者还将描述PAT在柱效实时监测和作出准确柱切换决策中的应用，同时将讨论将多波长UV吸光度、电导率、pH值和循环体积等工艺信息与产品步骤收率及纯度等关键信息相联系的模型。
结果
生物反应器内的细胞密度，以及每日未纯化样品及亲和层析纯化样品中的产物滴度。
为期35天的生物反应器灌流运行中的营养物和代谢废物控制。
不同流速条件下，结合载量的变化。图中可见，相比当前的行业实践，文章介绍的方法在优化动态结合载量方面具有明显的优势。
A）连续抗体捕获过程中的UV和电导趋势。图中仅显示层析柱失败前24 hr，以突出始终如一的层析柱性能以及可观察的层析柱故障。点A指示洗脱峰最大值与之前的值发生可见偏差的点。B）单根预装层析柱中，最后40个循环的洗脱峰半峰高处的峰长。
详细实验结果，请参考原文。
总结和讨论
OCC方法作为整合式连续生物生产工艺的技术平台，与之前提出的整合式连续工艺相比，在节约成本、易于实施和灵活性方面具有多个优势。该设置已成功地用于在相对延长的时间内，生产和捕获单克隆抗体。该平台提供了一种高效且经济的方法，以实现整合式连续生物生产，适用于多种不同治疗性蛋白质的生产。
本研究通过对细胞培养基进行优化，将上游灌流速率降低至1VVD。结果是获得了两种优化的培养基：一种用于生长，另一种用于生产。这两种优化的培养基简化了工艺操作，最终使生产背景下的执行更少受干扰。低灌流速率保证了生物反应器灌流液的浓度足够高，同时降低了进入下游处理的物料体积。
更高的滴度结合更低的处理体积，可允许使用尺寸更小的亲和层析柱（<1%反应器体积）、更低的表面速度以及较高的保留时间。这些下游操作条件优化了Protein A的使用，形成了优化的动态结合载量，并获得了接近100%的载量利用率。
除此之外，该平台可以在基于现有设备的不同生产环境中实现，而不需要购买可能需要工厂布局调整的昂贵新设备。这对于在生物仿制药中的应用、以及仍有很高失败几率的早期工艺开发来说，尤其重要。当前方法的验证在使用50L生物反应器的中试规模条件下进行，操作以连续模式进行60天，生产了足够用于人体中首次研究的物料，这将为业内专家提供非常有用的数据，以在当前和未来的产品中，探索创新的方法，以采用整合式连续生物生产。该平台为cGMP生产提供了一个有吸引力的选择，特别是对于资源有限的小公司、初创企业和学术研究机构。这种方法令人信服的经济效益可能会潜在性地鼓励行业从业人员进行必要的投资，这无疑将推动该行业走向一个新的、更有利的未来。
原文：M.Kamga, M.Cattaneo, S.Yoon, Integrated continuous biomanufacturing platform with ATF perfusion and one column chromatography operation for optimum resin utilization and productivity. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2018, DOI: 10.1080/10826068.2018.1446151.
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