“CAR-T之父”Carl June发布最新Nature，探讨CAR-T疗法超越癌症的进化之路
Carl June 教授被誉为“CAR-T之父”，他于2010年率先将CAR-T细胞疗法推进到人体临床试验，并成功“治愈”了多名白血病患者，是CAR-T细胞疗法的关键推动者和创始人之一。最近，Carl June教授等在Nature发表了题为：CAR T therapy beyond cancer: the evolution of a living drug 的文章。
这篇文章回顾了CAR-T疗法背后的基本原理，CAR-T疗法目前面临的挑战，非肿瘤领域的应用以及相关新兴技术的讨论，还强调了对CAR-T疗法的特异性和安全性的关注，并概述了CAR-T疗法超越癌症的未来之路。
在过去的十年中，CAR-T疗法改变了肿瘤治疗的格局，新兴的治疗手段为肿瘤患者带来了更多选择。如今，全球已有9款CAR-T疗法获批上市用于治疗血液肿瘤。CAR-T疗法的成功应用，让许多绝望的人重新燃起了希望，也标志着细胞治疗时代的到来。
其实CAR-T的诞生最早并不是为了应对肿瘤，而是为了重新定向T细胞使其能够消灭人类免疫缺陷病毒（HIV），虽然早期的实验结果不尽人意，但是随着研究者的不断尝试优化下，CAR-T在治疗复发难治性的血液肿瘤中展现出传统疗法无可比拟的治疗效果。这些临床实验的成功令人振奋，也持续推动着细胞治疗的发展。
近年来，科学家们一直在努力将CAR-T疗法应用于除血液类癌症以外的癌症类型，例如各种实体瘤。
随着实验的进展，研究者发现CAR-T疗法除了用于肿瘤治疗外，同时在治疗自身免疫、慢性感染、心脏纤维化、衰老相关疾病和其他疾病方面，CAR-T也有巨大的潜力。
CAR-T疗法的潜在治疗领域
所谓CAR-T疗法，是将T细胞的杀伤效力与抗体的特异性结合起来，从而实现精确地杀死患病细胞。单链可变片段（ScFv）赋予特异性，而细胞内信号域激活T细胞介导的细胞毒性。第一代CAR结构由CD4细胞外结构域与CD3ζ信号结构域结合组成，但这些结构缺乏效力，这推动了包括CD28或4-1BB等共刺激结构域的第二代CAR的发展，这提高了其效应功能和持久性，目前这些CAR-T细胞已被美国FDA批准用于治疗白血病和淋巴瘤等血液类癌症。对这些受体进行微调导致新一代的CAR消除抑制结构域，引入显性负受体或突变共刺激结构域以提高疗效。
CAR-T细胞的工程化设计
CAR-T疗法与传统的癌症治疗药物/疗法相比，有许多独有的特征。其内在特异性是目前小分子药物所无法比拟的。CAR-T细胞作为一类活细胞药物，依靠T细胞的细胞毒性，通过这种高效的内源性途径，即使单个CAR-T细胞也可以呈指数增长，从而杀死数百甚至数千个靶细胞。当靶细胞被清除后（抗原不再存在），CAR-T细胞仍可以存在并持续巡逻超过十年时间，从而防止疾病复发。
CAR-T疗法已经有多年的研发和临床经验，大量临床数据证实了CAR-T细胞的可行性，目前全世界已有超过1.5万人接受了CAR-T治疗，还没有看到任何患者中发生自体CAR-T细胞转化为恶性细胞。
CAR-T疗法面临的挑战
尽管CAR-T疗法在血液类癌症中的临床疗效显著，但仍有一些亟待解决的问题。首先是安全性问题，细胞因子释放综合征（CRS）是CAR-T治疗最常见的并发症，它的发生主要是由于短时间CAR-T的大量扩增导致细胞因子大量释放，使患者发烧、低血压甚至器官衰竭或死亡。另一个主要障碍是on-target、off tumour毒性，也就是CAR-T细胞靶向了肿瘤细胞以外的健康组织/细胞的目标抗原，当目标抗原存在于重要组织时，这可能导致严重的毒性甚至死亡。
除此之外，由于自体CAR-T细胞的制造是一项新兴技术，治疗的成本很高。价格是不得不考虑的现实因素。国内100多万一针的CAR-T细胞药物让许多患者望而却步，不过随着商业保险的完善，不少产品将覆盖CAR-T细胞药物，这或许会解决一部分患者的经济难题。
CAR-T疗法在实体瘤中的应用
实体瘤在癌症中占比超过90%，而目前全球上市的CAR-T产品适应症均为血液瘤，实体瘤的市场和医疗需求远远没有得到满足。因此，靶向实体瘤的CAR-T细胞获得了大量的科学和临床关注。
和血液瘤相比，实体瘤面临更加棘手的难题，与B细胞恶性肿瘤普遍存在肿瘤特异性抗原相反，实体瘤是高度异质性的，极少存在肿瘤特异性抗原。因此，在实体瘤的CAR-T治疗中，通常将肿瘤中过度表达的抗原作为靶标，然而，这些抗原通常在健康组织中有着不可忽略的低水平表达，从而导致治疗相关毒性作用。
此外，实体瘤的肿瘤微环境（TME）也是一大挑战，他们有够抵御CAR-T浸润的天然物理屏障，并且肿瘤内部的酸性环境以及特殊的细胞因子会产生免疫抑制。正是这些难题使得CAR-T疗法在实体瘤临床研究中进展缓慢。但研究者们也在积极开发新的方法力求攻破难关。例如开发新的技术平台Trans-CAR，CAR的表达随着靶抗原密度而调节，减少on-target off-tumor毒性，减少tonic signaling，增强安全性；Boost-CAR技术平台可以阻断免疫负调控途径，克服肿瘤微环境。
CAR-T疗法新的战线
多年的研究和临床经验证实了CAR-T疗法消除特定的细胞群具有治疗效果；这些细胞群可以被特异性靶向。
这让研究者们不仅仅局限于肿瘤研究，也将目光放到了由于特殊细胞群体的病变导致的其他难治性疾病。
最新发布的临床和临床前研究显示，CAR-T细胞的确可用于治疗自身免疫疾病、慢性感染、心力衰竭和其他慢性疾病。
Carl June教授在文中从理论的角度阐述了CAR-T细胞用于治疗非癌疾病的可行性。
新兴技术在CAR-T上的应用
随着基因编辑技术与mRNA疫苗技术的飞速进展，CAR-T疗法正在不断融合新兴技术，迅速发展。
01CRISPR基因编辑技术
在首次CAR-T治疗癌症的临床试验后不久CRISPR基因编辑技术诞生，其强大的基因组编辑能力提高了基因工程T细胞的效力和持久性。基于CRISPR的CAR-T细胞疗法已经进入临床试验，目前正在评估其安全性和有效性。
02靶向性mRNA递送
FDA 批准的针对 2019 年冠状病毒病的疫苗证明了 mRNA 疗法的广泛功效。尽管 FDA 批准的疗法是非靶向的，但目前正在进行多项使用靶向脂质纳米颗粒 (tLNP) 将 mRNA 特异性递送至选定细胞的临床试验。这种技术主要是通过将靶向抗体结合到 LNP 表面来实现的。
已经有多个研究小组证明可以将修饰后的 mRNA CAR在体内递送至 T 细胞。在白血病和前列腺癌小鼠模型中， mRNA 工程化 CAR-T 细胞的表现与逆转录病毒工程化 CAR-T 细胞类似，可以控制肿瘤并提高生存率。另一项研究表明，tLNP 可以将anti-FAP CAR mRNA 传递至小鼠的 T 细胞，从而在心力衰竭模型中产生 CAR的表达并成功减少纤维化最终改善心脏功能，这与之前逆转录病毒转导的 anti-FAP CAR-T 研究结果相似。因此，仅通过单次注射tLNP包裹的mRNA就可以在体内产生具有功能性和治疗水平的CAR-T细胞。
与目前临床使用的方法相比，tLNP 介导的 CAR mRNA 递送具有明显的优势。首先是成本。目前，CAR-T疗法需要昂贵的离体制造过程。在患者体内生成 CAR-T 细胞将降低制造成本并实现快速扩展。其次是安全性。目前的疗法需要在 CAR-T 细胞输注之前进行淋巴细胞清除，以优化植入。这一过程会增加由于 CAR-T 急性扩增而导致 CRS 风险，以及由于基因毒性而导致继发性恶性肿瘤的风险。体内生成可以有效避免这些问题，提高安全性。
最重要的一个潜在优势是，mRNA 递送的方式使 T 细胞表达 CAR 具有瞬时性，在mRNA 降解后会丢失。目前的 CAR-T 是稳定表达 CAR，并且可以在某些患者体内持续数十年。当然，就癌症而言，持久性是一个优点，但对于不希望或不必要持续清除的疾病来说，可能是一种负担。例如，一次性去除一部分心脏纤维化可能足以改善心肌收缩力，而长期抑制纤维化可能会抑制其他重要过程，例如纤维化介导的伤口修复。
体外CAR-T疗法和体内CAR-T疗法的比较
03通用现货性CAR-T疗法
通用现货性CAR-T疗法（同种异体CAR-T疗法），这种疗法依然依赖于体外工程化改造，但不使用患者自体T细胞，而是使用从健康供体或iPSC来源的细胞。在癌症治疗中使用同种异体CAR-T细胞具有巨大吸引力，能够大幅降低成本、简化生产流程、扩大患者治疗范围，目前已进入临床试验阶段。
尽管同种异体CAR-T细胞有潜在优势，但其需要对T细胞进行基因编辑改造以防止GvHD和同种异体CAR-T细胞的排斥反应。尽管同种异体CAR-T细胞的临床应用尚处于早期阶段，但与自体CAR-T细胞相比，其持续时间较短。这可能是由于宿主细胞的抵抗，也可能由于基因编辑改造导致这些T细胞具有内在缺陷。这些T细胞持久性的减弱可能对于那些不需要持久靶向的疾病具有吸引力。此外，这种设计基因编辑改造的CAR-T细胞的安全性值得额外关注。
除了上述方法，文中还列举了一些研究者做出的尝试，例如有研究者通过引入“合成细胞电路”的概念来设计CAR-T，举例来说就是“AND电路”需要两个独立的受体分别结合它们的抗原才能激活CAR-T细胞，此外，还包括又抑制信号介导的“NOT电路”以及与Notch信号通路介导的“IF-THEN电路”。这些策略可以提高过继细胞的效力、降低毒性或调节 CAR 表达。另外一个方向是工程化其他免疫细胞。在自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B 细胞和 γδ T 细胞中表达的 CAR 已显示出一定的临床前潜力。与 αβ T 细胞（即传统CAR-T工程化的T细胞）相比，改造这些细胞可能会降低 GvHD 和 CRS 的风险。
所有这些研究者的尝试都为CAR-T摆脱现在的困境带来了新的曙光。
CAR-T的未来之路
CAR-T在不同疾病领域的应用，以及与新兴技术融合的成果已经在临床前或早期临床阶段得到了验证，但是要成功完成临床转化，成为一款稳定的药物，还有很长的路要走。
01发现抗原
找到合适的抗原是最关键的问题。目前常用的方法是通过转录组或者其他组学数据找到靶组织或靶细胞的特异上调的抗原。找到可靶的抗原是第一步，接着需要关心的是安全性问题。
02安全性问题
细胞因子释放综合征（CRS）。CRS是CAR-T治疗中最值得关注的临床毒性之一。临床应用前应仔细检查CRS样症状是否出现在新的疾病应用中。CAR-T治疗系统性红斑狼疮的早期临床试验表明，在非癌症疾病中，靶细胞负荷相对较低，CRS可能较轻，但还需要在更大规模的临床试验中进行进一步评估。在心脏衰竭的临床前CAR-T治疗中，小鼠没有出现血清细胞因子增加，体重没有变化，伤口愈合也没有延迟。但在人类中，较高水平的纤维化的清除可能产生CRS样症状。
清除生理细胞。消除健康细胞亚群，例如系统性红斑狼疮患者的B细胞，具有治疗疾病的效果。然而，清除这些细胞的长期效果尚不清楚。系统性红斑狼疮的初步临床结果表明，这种清除可能只是暂时的。随着这些试验的扩大，我们将了解是否存在长期并发症。尽管慢性纤维化是病理性的，但是否存在消除活化成纤维细胞产生负面影响的情况仍有待观察。衰老细胞在发育、伤口愈合和再生中发挥着重要生理作用，应评估senolytic CAR-T细胞对生理过程的影响，并优先选择靶向病理性衰老细胞的抗原。从这个角度来看，瞬时CAR-T细胞特别具有吸引力，因为它不会产生这些潜在的长期安全性风险。
03关键性问题
在癌症以外的CAR-T细胞治疗领域仍有许多问题未被探索，在未来几年回答这些问题将是至关重要的。
CAR-T细胞的治疗指数仍然是一个重要的研究领域，因为输注剂量是管理安全性问题的重要方法，特别是mRNA CAR-T细胞。在急性和慢性疾病的情况下，还应仔细检查权衡瞬时CAR-T疗法，这些疾病的最佳给药时间是未知的，并且可能根据每种疾病的发病机制而变化。应该确定是否存在一个不可逆转的时间点，在这个时间点后继续治疗可能不再有帮助，甚至可能有害。对于具有再生能力的组织，应确定清除病理细胞是否能使健康组织恢复活力。CAR-T细胞在非癌组织中的运输也应该被进一步研究。局部递送CAR-T细胞可能会产生更好的结果并减少潜在毒性。随着该领域的发展，阐明CAR的内在和外在变量将是至关重要的。
尽管还有一些问题亟待解决，但是我们前进的脚步从来没有停下。随着越来越多的 CAR-T 产品被应用于实体癌治疗，随之产生的长期随访数据也日益丰富，通过回顾这十年的研究，我们能够从中汲取到很多经验。CAR-T细胞在血液癌症中的成功应用为实体瘤治疗奠定了基础，而CAR-T在肿瘤学的成果将为其他疾病的转化应用提供关键的经验。
结论
尽管CAR-T疗法最初是针对艾滋病开发的，但由于其在血液类癌症中的成功而获得了广泛关注。如今，CAR-T疗法有望治疗更广泛的疾病。CAR的设计和递送方面的新兴技术扩大了这一潜力，其理论应用广泛，平台功能强大。
这种活细胞药物的巨大潜力，才刚刚拉开序幕。
END
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