双AAV基因疗法在欧提交CTA，国内多家企业蓄势待发
近日，Sensorion宣布已提交新的临床试验申请(CTA)，以启动双AAV载体基因治疗药物OTOF-GT在欧洲(法国，意大利和德国)的1/2期临床试验，治疗otoferlin（OTOF）基因介导感觉神经性听力损失。值得注意的是，当月10日Sensorion还向英国药品和保健产品监管局(MHRA)提交了OTOF-GT的CTA。不同的是，在英国的1/2期临床试验用以评估该药物在OTOF基因介导的6 - 31月龄听力损失患儿中的安全性、耐受性和有效性。
OTOF-GT使用一种腺相关病毒（AAV）载体将健康的OTOF基因传递到内毛细胞，进而恢复听力信号传导通路。OTOF-GT此前已于2022年9月获得美国FDA和欧洲药品管理局EMA的孤儿药认定，以及FDA的罕见儿科疾病认定。
感觉神经性听力损失是由内耳蜗感觉细胞或神经纤维功能障碍或损伤引起，常见于新生儿耳聋病例中。在美国和欧洲约有20,000人因OTOF基因突变而听力受损。治疗遗传性听力损失的疗法通常具有挑战性，因为需要传递到内耳中，但内耳又是嵌在颞骨中的非常小且脆弱的器官。
OTOF 基因在耳蜗、前庭和大脑组织中表达，编码翻译otoferlin蛋白，蛋白结构包含6个钙离子结合C2结构域。Otoferlin作为一种在耳蜗内毛细胞(IHC)中表达的蛋白质与钙离子感应器，对信号传递到听神经至关重要，参与感觉性耳蜗细胞(内毛细胞)的突触外细胞增生以及听觉毛细胞丝带突触水平的囊泡融合和填充。正常的otoferlin蛋白功能使内毛细胞受到声音刺激时释放神经递质，从而激活听觉神经元。当OTOF基因缺失或突变时，otoferlin蛋白的功能受损，耳朵接收到的听觉信号无法传递到大脑。
▲ 图片来源：Sensorion官网
OTOF-GT这种双重基因治疗方法已经在临床前研究的概念中得到证实，在基因敲除小鼠模型中，注入双AAV2 quadY-F OTOF载体，使得Otoferlin基因成功地输送到小鼠体内并观察到持久恢复耳蜗受体功能。
耳科基因治疗研究领域，国内企业最新进展
目前，助听器和人工耳蜗作为常用的耳聋临床治疗手段，虽然可以帮助大部分耳聋患者获得一定的听力，但难以治疗耳聋。以AAV为载体的基因疗法已经在多种单基因遗传性疾病中展现出强大的治疗潜力，“免疫豁免”给予了内耳与眼睛先天具备可进行AAV治疗的优势，然而针对眼部遗传性疾病的候选药物要远远超过先天性耳聋，究其原因主要有两点：1.野生AAV血清型对内耳细胞的感染能力不足，尤其是耳蜗支持细胞（SCs）；
2.常见突变基因，如otoferlin (OTOF)，超出了AAV载体的装载能力。
然而科学家们的探索步伐从不因这些桎梏而停止。除了上文中Sensorion研发的OTOF-GT外，Decibel Therapeutics其先导AAV基因疗法DB-OTO是欧洲首个获批进入临床的针对Otoferlin的基因疗法，临床试验申请于2022年2月24日批准。无独有偶，Akouos公司的AK-OTOF基因疗法也是利用两种AAV携带OTOF基因的不同片段，在细胞内完成全长OTOF基因的表达，该疗法处于1/2期临床试验阶段。足以见得，随着近两年新载体开发技术的更新，以上难题也被逐步攻克。虽然国内针对耳聋的基因疗法才刚刚迈入临床，但在该领域已硕果累累，并开始向临床转化。目前，国内有三家企业在开发治疗内耳听力损伤等相关疾病的基因疗法中遥遥领先，分别是鼎新基因、玮美基因、星奥拓维。
鼎新基因
鼎新基因是国内率先采用AAV双载体递送技术的基因治疗公司，选择了最合适的AAV亚型、表达原件以及重组位点，克服了OTOF基因较大的挑战。
2022年11月18日，鼎新基因与复旦大学附属眼耳鼻喉科医院合作的治疗先天性耳聋AAV基因疗法（RRG-003）已启动临床试验，这是国内开展的首个用于治疗耳聋的基因疗法临床试验。RRG-003是将AAV基因疗法应用于内耳，旨在根治恢复或改善OTOF突变耳聋患儿的听觉和言语功能，利用局部的微创给药将RRG-003递送到耳蜗内，采用了双载体策略，将otoferlin cDNA的5'-片段和3'-片段分别装载在不同的AAV载体中，通过反向末端重复重组产生可以翻译蛋白OTOF的转录物，从而补偿耳畸蛋白缺陷，达到恢复听力目的。
玮美基因
玮美基因专注于新型AAV载体的开发及听力缺失基因治疗管线的推进，已成功开发出高效靶向毛细胞和支持细胞的病毒载体AAV-ie，为全球听力疾病患者提供创新型的治疗方案。AAV-ie对于耳蜗支持细胞的感染率显著高于其他天然AAV型，能达到80%左右显示其在听力疾病治疗领域的潜力。玮美基因目前在眼科、耳科等系统拥有自主产权的高效AAV，为基因治疗不同领域的疾病提供更优越的递送载体。
而早在2019年8月19号，上海科技大学钟桂生研究团队等人在Nature Communications上在线发表了题为AAV-ie enables safe and efficient gene transfer to inner ear cells的研究论文。该研究鉴定出一种新型AAV变体-AAV-ie，可用于小鼠内耳中的基因递送。AAV-ie能高效转导耳蜗支持细胞（SCs），代表了对传统AAV血清型的巨大改进。此外，在AAV-ie介导的Atoh1基因转移后，研究人员发现许多SC转分化为新的HC。该研究结果表明，AAV-ie是一种有用的工具，可用于耳蜗基因治疗和研究HC再生的机制。
星奥拓维
星奥拓维以国际领先的双AAV基因递送、基因编辑和类器官等五大平台，针对感音神经性耳聋，开发基因递送、基因编辑和内耳毛细胞再生药物,并开展了一系列具有高度连贯性和系统性的工作，具体有以下四点：
靶向听觉关键细胞的AAV载体筛选：提高AAV转导效率、逃逸中和抗体、提高耳蜗细胞/组织特异性来实现更低、更安全的载体剂量。针对内耳特定细胞类型使用特定的启动子，提高靶向性，减轻对其他细胞的潜在毒性。
基因编辑工具的改造与筛选：建立了大规模测试CRISPR-Cas酶活性的方法，并对关键位点进行过改造和重组的CRISPR/Cas9基因编辑器进行筛选，开发具有基因片段小、活性高、编辑范围大等优点的新型CRISPR工具，包括Cas9和Cas12，在哺乳动物细胞中实现目标位点的高效编辑，用于耳聋的基因治疗研究。
遗传性耳聋的基因治疗：用高效的基因治疗递送载体以转染听觉内毛细胞，用AAV介导的基因递送和基因编辑精准补偿或修复受损基因，从而修复缺陷的毛细胞，使之发育成熟，发挥正常功能，达到修复听觉功能的目的。
内耳干细胞再生医学：内耳干细胞在体外可以模拟毛细胞和支持细胞的体内生成过程。结合AAV、基因编辑技术和干细胞技术，高通量寻找影响毛细胞功能的重要基因，筛选有效的毛细胞功能性再生方法，制定可用于人的成药策略。
结语
从企业布局来看，国内外大部分涉及大基因组包装的企业在攻克耳聋，且主要集中在双载体AAV治疗由OTOF基因突变引起耳聋方向。不过随着围绕载体和基因编辑工具的不断优化，AAV载体能够携带的基因组将可能进一步扩大，届时这一疗法也将运用于更广泛的疾病治疗中。而在耳聋领域的基因疗法，除了目前基因导入、基因修复、毛细胞再生等途径实现治疗，未来也期待有mRNA疗法、细胞疗法，为受听力损失的患者提供多样化的治愈方式。
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