导读
单基因1型糖尿病（T1D）病例为研究自身免疫性疾病的机制提供可能。最新研究发现，与转录因子STAT3结合的基因功能获得性（GOF）突变会导致新生儿T1D的发生。为研究STAT3在T1D中的作用，本研究构建了一种新型基因敲入（KI）小鼠模型，即在与STAT3结合的基因中敲入高度致糖尿病的K392R基因突变。单细胞转录组和单细胞免疫组库测序发现，STAT3-GOF驱动细胞毒性T细胞的增殖，这些细胞毒性T细胞对CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）终末耗竭具有抵抗力。单细胞ATAC-seq显示这些效应T细胞在表观遗传上是不同的，并揭示了由STAT3-GOF诱导的染色质结构差异。胰岛TCR富集克隆型分析显示效应CD8+T细胞与已知抗原IGRP发生作用，并且IGRP反应性TCR转基因模型研究表明CD8+ T细胞中的STAT3-GOF足以加速糖尿病的发病。综上，本研究揭示了STAT3在T1D中的作用，以及T1D的发病机制。
Ø 材料：小鼠胰岛组织
Ø 方法：单细胞转录组测序、单细胞免疫组库测序、单细胞ATAC-seq
1、STAT3 K392R突变小鼠模型构建
利用CRISPR/Cas9构建一种新型基因敲入（KI）小鼠模型（STAT3+/K392R）（图 1a）。分别从STAT3+/K392R 和WT小鼠淋巴器官中分离出CD4+ 幼稚T细胞并在体外分化为Th17和Treg细胞亚群，比较发现STAT3+/K392R小鼠T细胞趋向于分化为Th17细胞（图 1b）。同时发现雄性和雌性STAT3+/K392R小鼠都比它们同胞的WT小鼠更快发展为糖尿病，并且发病率更高（图 1c）。STAT3+/K392R小鼠的免疫荧光显示其胰岛内α和β细胞分布正常，表明K392R突变小鼠β细胞发育正常，但同时出现了糖尿病与胰腺炎（图 1d），并且B细胞和T细胞快速浸润（图 1e），说明STAT3+/K392R小鼠模型出现了人类自身免疫性糖尿病的表型。
图1 STAT3+/K392R突变小鼠重现人类1型糖尿病表型
2、STAT3-GOF可上调CD8+ T细胞中与趋化性和细胞毒性相关基因的表达
从8-10周龄非糖尿病小鼠胰岛中分离CD45+淋巴细胞，进行单细胞转录组和免疫组库测序（scRNA/TCR-seq），共得到8,725个CD3+ T细胞（图 2a），比较STAT3+/K392R与WT小鼠的细胞聚类结果，发现效应CD8+ T细胞显著增加，幼稚CD8+ T细胞减少（图 2a），并且STAT3+/K392R小鼠中与趋化性（如Ccl4、Ccl5）和细胞毒性（如 Gzma、Gzmb、Gzmk）相关的基因上调表达（图2b）。在蛋白水平验证，发现从STAT3+/K392R小鼠胰腺淋巴结分离的CD8+ T细胞中Ccl5蛋白较WT小鼠表达增加（图 2d）。同时利用聚类得到的2,034个CD8+ T细胞进行cluster聚类来区分终末耗竭T细胞（Cd101、Cd200r2、Cd7、Cd200r1、Il10）和暂时性T细胞（Cx3cr1、Klrg1、Il2ra、Il18rap、S1pr5）（图 4f），再通过已知的CD8 marker来鉴定细胞群（图 2e），最终发现STAT3+/K392R偏向于暂时性CD8+ T细胞表型（图 2g）。由于两种聚类细胞（图 2h）在STAT3+/K392R和WT小鼠的中表达有差异（图 2b），因此表明STAT3+/K392R的CD8+ T细胞的表型差异是由与细胞毒性相关的基因表达上调引起的。
图2 STAT3+/K392R通过细胞因子和趋化因子基因的上调驱动CD8+效应区的扩张
3、STAT3-GOF通过表观遗传的方式调节效应CD8+T细胞中的趋化和细胞毒性基因表达
对8-10周龄非糖尿病小鼠的CD45+细胞进行了scATAC-seq，并从17,466个单细胞中获得了高质量的ATAC-seq数据，细胞获得片段数的中位数为5,610个，Tn5插入转录起始位点的中位富集区17.11。为了识别细胞类型并确定scRNA-seq聚类细胞和scATAC-seq富集之间的对应关系，通过每个细胞中的基因body区和启动子上聚合的ATAC-seq信号来计算（图 3a）。通过分析聚类簇，能够将相同细胞类型的基因表达与表观遗传变化联系起来。染色质可及性分析有197个peak显著增加，其最近的基因有129个显著上调（log FC ≥ 0.25 和 padj ≤ 0.05，图 3b，c）。使用chromvar比较STAT3+/K392R和WT CD8+ T细胞之间转录因子的motif，确定了406个活性显著不同的motif（FDR ≤ 0.1，|mean difference| ≥0.01）。Eomes和Tbx21是两个活性明显的转录因子，并且在效应T细胞发育和功能中具有重要作用（图 3d、e）。
图3 STAT3+/K392R增加CD8+细胞毒性基因座内染色质的可及性从而导致不同的表观遗传
4、CD8+ T细胞中的STAT3-GOF可以加速 T1D发生
从scRNA/TCR-seq实验中获得的TCR数据，使用Gini指数来量化每个细胞聚类簇内TCR克隆扩增的程度，发现STAT3+/K392R的效应CD8+ T细胞克隆指数相对于WT增高。分析了前20个最丰富的CD8+ TCR克隆，发现Clone 6158同时存在于STAT3+/K392R和WT小鼠中（图 4a），该克隆包含的CDR3序列与TCR-8.3序列几乎相同（图 4b）。与STAT3-GOF对CD8+ T细胞的影响一样，STAT3+/K392R 8.3Tg+小鼠迅速出现糖尿病，并且糖尿病发病率远高于WT 8.3Tg+（图 4c）。过继转移小鼠模型研究发现过继转移了多克隆WT小鼠CD4+ T细胞和STAT3+/K392R 8.3Tg+小鼠幼稚CD8+ T细胞的NOD.SCID小鼠，比过继转移WT 8.3Tg+小鼠幼稚CD8+ T细胞的NOD.SCID小鼠，糖尿病发病速度显著增加（图 4d）。
图4 STAT3+/K392R驱动CD8+ T细胞的克隆扩增
CD8+ T细胞内的STAT3-GOF足以加速T1D的发生，从而证明了CD8+ T细胞中K392R突变的作用，并确定了CD8+ T细胞耗竭缺陷会促进T1D的发生发展。
参考文献:
Warshauer JT, Belk JA, Chan AY, et al. A human mutation in STAT3 promotes type 1 diabetes through a defect in CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 2021 Aug 2;218(8):e20210759.
推荐阅读
百迈客：10x单细胞转录组与空间转录组联合分析一睹为快
空间转录组-在生长发育中的应用2
空间转录组-在癌症中的应用1
单细胞转录组应用4——结直肠癌研究
单细胞&空间转录组应用3-动植物研究“遍地开花”
单细胞转录组应用2——食管鳞状细胞癌研究
单细胞转录组应用1——衰老研究
NC-单细胞VDJ和转录组分析揭示了葡萄膜黑色素瘤 新的进化复杂性
snRNA-seq|首个灵长类动物心肺的单细胞转录组图谱揭示新冠易感人群
Nature Medicine | 单细胞免疫组库揭示溃疡性结肠炎中结肠T细胞图谱
百迈客生物基于高通量测序技术、生物信息分析技术和生物云计算技术，为广大科研工作者提供以综合技术服务、生物云分析、三代高通量测序以及试剂、仪器等科研周边业务。
公司拥有Nanopore、PacBio、Illumina、Waters、10XGenomics等主流服务平台，以及基于云架构的生物云计算平台—百迈客云，提供涵盖人重外显子、三维基因组、单细胞与空间转录组、基因组组装、转录调控、微生物、群体遗传、质谱及表观遗传等研究方向的技术服务。目前百迈客云平台拥有200多款基因分析工具，分析结果可直接用于文章发表，更有近百部科研相关视频和8大基因数据库助力科研工作者深度数据挖掘。
自公司成立起先后在《Cell》、《Nature》、《Nature Genetics》、《Nature Communications》、《Plant Cell》等学术刊物发表论文数千篇，拥有国家发明专利技术40余项，软件著作权近200余项。
我们一直秉承”生物科技创新，服务社会，造福人民”的企业使命，致力于打造“生物科技创新中心”的发展愿景，让生物科技更快，更好的提高人类生活质量。