食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，发病率在全部恶性肿瘤的发病率中约为第6位，死亡率约为第4位。组织学上，食管癌可分为腺癌(EAC)和鳞状细胞癌(ESCC)两种亚型。ESCC是食管癌的主要亚型，约占全球食管癌的90%。由于缺乏有效的生物标志物，许多ESCC患者被诊断为晚期，并且在这个阶段往往已经发生远处转移，导致预后不良。目前，由于缺乏有效的诊断和预后生物标志物，ESCC患者5年生存率低于30%。而且，晚期食管鳞癌患者常伴有巨大的疼痛，如进食困难、呼吸困难等，这些疼痛通常难以治疗。因此，迫切需要寻找更有效的ESCC生物标志物，以提高ESCC的诊断和治疗效率。随着单细胞测序技术的进步，现在可以在单细胞水平上分析高度异质组织内基因转录的变化。单细胞测序提供了一种表征组织异质性的方法，并提供了确定影响临床结果(包括预后和治疗反应)的关键分子特性的机会。目前食管鳞状细胞癌在单细胞水平的研究进展如何，我们挑选几篇从不同角度进行借鉴借鉴，站在前人的肩膀上，相信肯定能看的更远，飞的更高！常规RNA测序与单细胞水平测序[1]
食管鳞状细胞癌(ESCC)是世界上某些地理区域的高发肿瘤。食管鳞癌的发展呈现一个从炎症到浸润性癌的多步骤致病过程；然而，在这些过程中什么是关键的以及它们是如何演变的在很大程度上是未知的，这阻碍了早期诊断和有效的治疗。在本文，建立了一个模拟人类ESCC发育的小鼠模型（用4-硝基喹啉1-氧化物(4NQO)饮水法处理小鼠16周，诱导ESCC多阶段癌变），并构建了单细胞ESCC发育图谱，确定了一组与上皮细胞致癌进化相关的关键过渡特征，并描绘了具有里程碑意义的动态肿瘤发生轨迹。随着免疫应答从1型向3型的转变，CD8+反应早期下调以对抗最初的组织损伤，导致巨噬细胞和中性粒细胞的聚集和激活，这可能会创造一个慢性炎症环境，促进致癌物转化的上皮细胞的生存和增殖。这些发现揭示了ESCC是如何发起和发展的。
食管上皮切片苏木精-伊红(H&E)染色和免疫组织化学(IHC)分析明确了正常(NOR)、炎症(INF)、增生(HYP)、异型增生(DYS)、原位癌(CIS)和浸润性癌(ICA)6种不同的病理改变。
食管鳞状细胞癌(ESCC)是一种由异质细胞组成的肿瘤，极易发生放射抵抗，导致肿瘤复发。食管癌最常用的治疗方法是分次照射(FIR)疗法，它利用电离辐射直接诱导细胞毒细胞死亡。然而，由于高度适应性的进化，这种治疗可能不能消除所有的癌细胞。
为了确定食管鳞癌复发过程中的转录组动态变化是否与FIR反应有关，本研究建立了食管鳞癌放射抗性的体外细胞培养模型，该模型模拟食管鳞癌患者常见的放射治疗过程。对体外培养的ESCC细胞使用不同的累积辐射剂量，以及FIR治疗的ESCC患者在发生辐射抵抗之前和之后的肿瘤样本进行高通量测序分析。
已鉴定的辐射抗性相关基因和信号通路包括与低氧反应相关的自噬相关基因9B(自噬调节)、γ损伤诱导转录本4、肌红蛋白和纤溶酶原激活剂组织类型、Bcl 2结合成分3、肿瘤蛋白p63和干扰素DNA诱导蛋白16。采用单细胞RNA测序方法，进一步研究了原代(41个单细胞)、12GyFIR处理(87个单细胞)和30GyFIR处理(89个单细胞)癌细胞在获得性辐射抗性过程中的异质性和基因表达的动态变化。本研究的结果在人群和单细胞水平全面描述了食管癌体外模型和患者肿瘤样本获得性辐射抗性过程中的转录组动态。单细胞RNA测序揭示了辐射后ESCC细胞的异质性和获得性辐射抵抗期间耐辐射ESCC细胞亚群的增加。总体而言，这些结果具有潜在的临床意义，因为它们确定了一些与辐射抵抗相关的信号分子，以及为治疗ESCC开发新的治疗选择的机会。
诱导ESCC细胞抗辐射的方案设计
背景：食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞异质性强，易发生辐射抵抗，易复发。scRNA-seq是一种新一代测序方法，它可以描绘单个细胞的不同基因表达谱，并挖掘它们对辐射的异质性行为。本文的目的是利用scRNA-seq来描述亲本细胞和获得辐射抗性的细胞之间的差异，并研究细胞转录组对FIR的响应的动态变化。结果：本文对分次照射(FIR)前后的食管癌细胞株KYSE180进行了测序。共获得218个scRNA-seq文库，其中88个细胞经12Gy(KYSE-180~12Gy)照射，89个细胞经30Gy(KYSE-180~30Gy)照射，41个亲代KYSE-180细胞未经FIR照射。综合考虑基因和生物学途径，确定动态基因表达模式。生物学实验表明，经FIR处理后，KYSE-180细胞出现辐射抗性。对scRNA-seq数据进行主成分分析表明，KYSE-180、KYSE-180-12Gy和KYSE-180-30Gy细胞彼此分离。KYSE-180~12Gy组有2个亚群，KYSE-180~30Gy组仅有1个亚群。这些亚群基因与PI3K-AKT途径、逃避凋亡途径、肿瘤细胞迁移、转移或侵袭途径以及细胞分化和增殖途径有关。结果验证了这五个途径中的DEG，如CFLAR、LAMA5、ITGA6、ITGB4和SDC4基因，在来自接受放射治疗的食管癌患者的食管癌组织和KYSE-150细胞系的批量RNA-seq数据中，可以作为辐射抗性基因。结论：数据结果描述了单个ESCC细胞暴露于FIR的差异基因表达模式，并显示了与辐射抗性发展相关的基因和生物学途径。
KYSE18012Gy和−30Gy细胞5条辐射抗性途径的动态变化KEGG ID：hSA05200(I)、hSA04210(II)、hSA05205(IV)和hSA04150(V)在两种剂量的FIR中均可被诱导，并与避免凋亡和促进肿瘤细胞迁移、侵袭、分化和增殖有关。下表显示了批量细胞数据的验证结果。食管鳞状细胞癌（ESCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一。食管鳞癌预后一般较差，缺乏诊断和预后的生物标志物。本研究的目的是寻找新的食管鳞癌生物标志物。从GEO数据库中ESCC数据集和TCGA数据库中ESCC数据集中筛选获得了交集的差异的6个表达基因（DEGs）。随后，进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析以确定关键枢纽基因。然后利用Kaplan-Meier生存率和受试者操作曲线（ROC）分析阐明这些hub基因的诊断和预后作用。通过UALCAN数据库、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和实时定量PCR（qPCR）检测hub基因的表达水平。最后进行免疫浸润分析，探讨这些基因在ESCC发病机制中的作用。结果表明，PBK、KIF2C、NUF2、KIF20A、RAD51AP1和DEPDC1能有效区分ESCC组织与正常组织，且与总生存率显著相关。scRNA-seq和qPCR结果表明，hub基因在ESCC中的表达水平明显高于正常细胞或组织。进一步的免疫浸润分析显示树突状细胞的浸润与PBK、KIF2C、NUF2、RAD51AP1和DEPDC1的表达水平呈显著负相关。总之，本文的结果提示PBK、KIF2C、NUF2、KIF20A、RAD51AP1和DEPDC1都是ESCC诊断和预后的潜在生物标志物，也可能是ESCC的潜在治疗靶点。
ESCC中新型生物标志物的筛选流程图
ESCC中hub基因的scRNA-seq分析和qPCR检测
20世纪90年代，紫杉醇被引入食管腺癌（EAC）和鳞状细胞癌（ESCC）的临床治疗。最初对紫杉醇的反应很高，但是由于患者出现化疗耐药，总体生存率的改善没有太大改变，有时紫杉醇甚至与其他化学药物联合使用也会产生耐药性。紫杉醇耐药在食管癌治疗中频繁发生，其机制尚不完全清楚。耐药癌细胞内基因表达的异质性可能是导致其耐药的主要因素之一。在本研究中，通过低剂量和长期使用紫杉醇成功地诱导食管癌细胞株KYSE-30产生紫杉醇耐药。用群体RNA-seq和单细胞RNA-seq(scRNA-seq)测定基因表达谱。对37个KYSE-30细胞和73个紫杉醇抗性KYSE-30细胞(Taxol-R)进行scRNA-seq分析。对scRNA-seq数据的加权基因共表达网络分析(WGCNA)揭示了KYSE-30和Taxol-R癌细胞中的两个主要亚群。KYSE-30细胞中基于KRT19表达水平的两个亚群表现出不同的紫杉醇敏感性，提示KYSE-30细胞存在内在的紫杉醇耐药。此外，通过诱导获得紫杉醇抗性的Taxol-R细胞具有较高的蛋白酶体表达和较低的HIF-1信号基因表达。此外，本文还发现蛋白酶体抑制剂carfilzomib(CFZ)可以通过激活HIF-1信号来减弱Taxol-R癌细胞对紫杉醇的耐药性。本文的新发现可能会为改善包括食管癌在内的癌症的治疗铺平道路，将CFZ和紫杉醇联合作为一种新的癌症治疗方法。
食管鳞癌紫杉醇耐药形成图及临床肿瘤治疗的新策略
2.1食道癌的免疫检查点抑制剂：能在迷雾中找到正确的道路吗？[7]食道癌仍然是一种具有挑战性的疾病，因为治疗选择有限，预后很差。近年来，免疫检查点抑制剂(ICI)已被证明在治疗非小细胞肺癌和黑色素瘤等高致命性恶性肿瘤方面是安全有效的。最近的临床试验还显示，免疫检查点抑制剂在预处理的晚期食管癌中具有良好的活性，对选定的患者的预后有潜在的重大影响，而不受组织学的影响。评估免疫治疗和化疗以及局部疾病放射治疗的联合研究正在进行中，有望在不久的将来证实他们的承诺。然而，可靠的预测生物标记物仍然缺乏。目前，程序性细胞死亡配体1的表达和其他因素(如微卫星不稳定性和肿瘤突变负荷)作为免疫检查点抑制剂的预测的生物标志物的作用仍然存在争议。本文目的是探索ICIS在食管癌治疗中的理论基础，回顾已经在多个环境下获得的结果，并用单一药物和联合策略调查未来的前景。许多I-II期试验已经评估了免疫检查点封锁在食管癌中的作用，见下表食管癌临床试验总结：
背景：T细胞受体工程T细胞(TCR-Ts)治疗是一种很有前途的肿瘤治疗策略。目前，大多数研究都集中在针对体细胞突变产生的新抗原的高亲和力T细胞受体(TCR)的鉴定上。然而，在上皮性癌患者中，几乎没有新的抗原能够诱导免疫应答，而且许多肿瘤特异性抗原可能来源于非编码区。自体肿瘤细胞(ATCs)可以作为激活和富集肿瘤反应性T细胞的无偏刺激因子。然而，目前尚不清楚从ATCs富集的肿瘤反应性T细胞中分离出的表达TCR的工程T细胞是否具有很强的抗肿瘤反应。方法：本研究从1例食管鳞状细胞癌(ESCC)患者的TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）片段中筛选出ATC特异性识别的TIL片段。肿瘤反应性TILs通过体外反复刺激ATCs而富集，并在CD137上调的基础上分离出来。随后，通过单细胞RT-PCR分析获得肿瘤反应性TCR，并将其导入外周血淋巴细胞产生TCR-Ts。结果：本文发现来自不同肿瘤部位的TIL片段的表型和效应功能在空间上是不同的。在4个TIL片段中，只有TIL-F1能特异性识别ATCs。随后，本文从TIL-F1与ATCs共培养前后的细胞中分离出CD8+CD137+T细胞，并鉴定了它们最主要的TCR。将此TCR导入PBLs（外周血淋巴细胞），产生TCR-Ts，在体内和体外特异性识别和杀伤ATCs。结论：这一策略为食管癌提供了产生肿瘤反应性TCR-Ts的方法，这对事先不知道特定表位的患者尤其重要，并可能应用于其他癌症。
从CD137阳性TIL-F1中分离TCRs及相应TCR-Ts的功能验证流程图背景：正常的机体免疫功能是抵御肿瘤发生和发展的重要环节，肿瘤微环境中的免疫细胞是机体抗肿瘤的重要组成。充分理解肿瘤微环境中免疫细胞的功能状态及调控网络将有效提高肿瘤的免疫治疗效果，从而延长患者的生存期。食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，治疗效果较差，其肿瘤微环境中免疫细胞的组成和功能仍未获得充分的认识。方法：首先利用流式细胞分选技术分离7个ESCC（食管鳞状细胞癌）患者的食管癌和癌旁组织中的CD45+免疫细胞，然后进行单细胞测序和T细胞受体（TCR）克隆测序分析（10× Genomics single-cell 5′ + VDJ 测序），从而建立80787个细胞的单细胞转录组学数据。结果：该项研究揭示了ESCC患者之间，肿瘤免疫微环境存在着显著的异质性。与配对的相邻组织相比，ESCC肿瘤组织中浸润的T细胞显著增多，且克隆扩增增加。同时，在肿瘤组织中发现了耗竭性T细胞，耗竭性NK细胞，调节性T细胞（Treg），M2型巨噬细胞和耐受型树突状细胞（tDC），而耗竭性T细胞和NK细胞是TME（肿瘤免疫微环境）中主要的增殖细胞，提示ESCC微环境中炎症与免疫抑制共存的状况。TCR测序结果揭示了T细胞亚群的谱系关联，发现耗竭性CD8 T细胞存在从预耗竭状态到耗竭状态的连续演变过程，而预耗竭T细胞可能是更好的免疫治疗潜在靶标。该研究进一步通过肿瘤微环境中的免疫细胞进行大量的功能性实验来验证单细胞转录组的结果。通过“配体-受体”相互用作分析发现了Treg与巨噬细胞之间的相互作用，提示与肿瘤的进展和免疫抑制状态紧密相关，阻断该途径可能促进ESCC的抗肿瘤免疫。此外，该研究利用数据分析技术得到一系列与ESCC患者生存期相关的标志基因。结论：该研究结果全面系统的分析了ESCC肿瘤浸润免疫细胞的特征，揭示了ESCC肿瘤微环境中抑制性的免疫状态，并为应用和开发全新的ESCC免疫疗法奠定了基础。实验设计与分析原理图
Tips:想要获取原文请在后台留言“单细胞转录组应用2-食管鳞状细胞癌研究”，即可获取相关全部文献！！！文：Tanbn&Anna
排版：市场部
参考文章
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