【空间转录组】样本制备（一）

空间转录组需要对组织进行切片。前期的实验流程为：新鲜组织取样-异戊烷冻存-OCT包埋-冷冻切片-染色-显微镜观察-建库测序。

需要客户准备的阶段为：新鲜组织取样-异戊烷冻存-OCT包埋。

客户在制备样本时，需要准备3份样本（至少2份）：一份用于常规RNA提取，以确保样本自身及样本制备不存在问题，当RNA RIN>8时，可进行后续实验；一份用于正常的切片实验；另一份用作备份。

样本制备实验具体流程

图1：组织冻存和包埋流程图

1 新鲜样本取样

1.1 建议针对活体或刚死亡个体进行解剖取样；

1.2 个体死亡后，实在无法立即解剖，需将生物体放入 4℃冰箱暂存，不可冻融；

1.3 所有器械和环境需要消毒灭菌；

1.4 在医用托盘上放一层冰块，然后覆盖上一层锡箔纸，再铺几层无菌布，将个体放在无菌布上进行取样。保持整个取样过程在低温中进行可以延缓核酸的降解；

1.5 取下新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。对肿瘤组织的取材，应尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净）；

1.6 迅速用预冷的 PBS 溶液（RNase free）或生理盐水将组织表面的残留血液冲洗干净，然后用干净的纱布或吸水纸将液体吸干净；

1.7 如果组织体积较大，应尽量将组织切成长宽高约0.8 cm 的小块（小拇指大小）。

2 异戊烷冻存

2.1 用异戊烷（足以完全浸没组织）填充三分之二的金属烧杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（与异戊烷相同的水平）以充分接触。孵育至少 15 分钟；

2.2 用镊子或抹刀将组织放入异戊烷中，直到完全浸没；浸泡至少1分钟；

2.3 组织冷冻结束后迅速转移到预冷的冻存管中，置于干冰上，并选用无核酸酶的试剂和耗材；

2.4 将冷冻组织在-80℃长期保存，或立即进行冷冻组织包埋；

2.5 为防止组织样品蒸发和脱水，快速冷冻的组织样品必须储存在密封容器中。

FAQ:可能有些老师要问，必须要进行异戊烷冻存吗，能否用其它方法替代？

答：目前必须用异戊烷。因为空间转录组样本制备时既要防止 RNA 降解，还要避免形成晶体，防止组织形态受损。冷冻新鲜组织时，组织不应直接置于液氮中，因为温度差可能会导致组织表面沸腾，从而导致气穴和不均匀的冷冻，这可能会破裂并在形态上破坏组织。而目前也没有更好的异戊烷替代试剂。

3 OCT包埋

3.1 标记一个合适大小的包埋模具以便记录组织放置的方向（可拍照记录），将模具放于碎干冰上。在加入OCT和组织之前，对包埋模具做标记。一旦冷冻，OCT很快就会变白，这使得以后很难确定组织的方向（图2）；

图2：OCT包埋：取一个合适的容器进行包埋，包埋时需要标记组织的方向

3.2 在包埋模具中注入冷冻OCT，避免产生气泡；

3.3 使用预冷镊子，将冷冻组织放入OCT中。用额外的OCT覆盖任何暴露表面；确认组织周围没有气泡；

3.4 立即将含有组织和OCT的冷冻模放在粉状干冰上，直至OCT完全冻结；

3.5 包埋后，对组织进行修理（图3），将多余的部分去掉，留下需要的组织块。此时的组织块保持在长宽高约0.8cm 的小块（约小拇指大小）最佳；

图3：包埋后修剪：将多余的部分去掉，留下需要的组织块，将组织块保持在长宽高约0.8cm 的小块（约小拇指大小）最佳

3.6 将OCT包埋的组织块在-80℃的密封容器中长期保存，或立即进行冷冻切片和切片放置；在-80°C保存时注意严格避免反复冻融。

FAQ：可能有些老师要问，必须要进行OCT包埋吗，其它类型的包埋能否做空间转录组吗？

答：是的，必须要做OCT包埋，因为它具有以下优点：

●保留组织结构并在冷冻切片过程中提供结构支撑；

●在切片过程中保持最佳温度，从而使切片光滑；

●由于其水溶性，可与多种染色程序兼容。

基于以上三点，OCT包埋更适用于空间转录组研究。

4 样本送样量及寄送保存

4.1 每块组织样本不宜过大（长宽高约0.8 cm ）;

4.2 客户需要同时制作多份样本（至少2份，建议3份），其中一份用于提取RNA，经过Agilent2100检测，RNA RIN>8则认为样本本身及制备过程没有降解，剩余的样本可以进行后续实验。

4.3 干冰环境寄送（推荐用量约5 kg/日），百迈客收到后将于-80°C冰箱保存。

样本到样后进行QC

样本到样后，我们会先取一份进行RNA提取。提取试剂用的是ThermoFisher的TRIZOL。提取后进行Agilent2100检测。检测结果良好（如下图，5s峰低，28s/18s>2，RIN值>8，说明RNA质量比较好，样本采集及样本制备没有造成额外的降解）可以进行后续的实验。

空间转录组对于样本类型要求较高，某些样本类型明确不适合进行该实验：皮肤、胰脏、骨类，软骨，FFPE等；

另外，该产品对于样本制备也有一定要求，常规样本类型提取RNA出现降解时，也是不建议再进行后续实验啦。

本期空间转录组实验篇，主要讲了客户朋友们需要配合进行的一些实验，整体比较简单，下期则带来百迈客需要负责的实验部分，包括切片染色及建库测序部分，下期再见！