近些年，随着转录组测序技术的推广和普及，大家对测序技术本身的要求越来越高了，比如碱基准确性、测序周期、reads读长、转录本水平的定量、结构分析准确性。三代测序技术从最初的蛰伏到现在的高歌猛进，在解决转录本精确定量和“仿真”的结构分析方面确实是有质的飞跃，这技术平台的一小步，在科研圈是实打实的一大步。日后，生物体的调控网络可以细化到同一个基因的不同转录本水平，这无疑提升了对生命调控机制复杂性的认知水平。Nanopore测序技术凭借“可以同时进行转录本精确定量和可变剪接等结构分析”的特点，在众多三代测序技术中脱颖而出，其独特的芯片和测序原理是关键。百迈客是中国大陆唯一通过 PromethION/GridION 双平台 DNA/RNA 全种类样本认证的公司，并且是大陆首批推出ONT全长转录组测序的公司。经过3年的研发测试，百迈客建立起完善的ONT全长转录组服务体系，实现线上线下同步分析。
目前，ONT技术的读长可以达到几十kb、上百kb以上，最新的数据显示单次最长读长已高于2Mb。Nanopore全长转录组，无需打断，直接通过polyA调取mRNA全长序列，因此通过ONT技术测得的mRNA是真正意义上的全长转录组。此外，还没有GC偏好性，可以直接读取DNA/RNA序列甲基化信息，可同时进行转录本定量和结构分析，在可变剪接、融合基因、基因家族等分析中有明显优势。从现有的数据中挑选出一些典型的动物和植物样品，统计显示样品数据量在6G-20G左右，其N50在1500bp左右，测序的平均长度在1~2kb之间，符合转录本长度的主要范围，平均质量值Q9以上。
大家习惯了转录组6G或者Pacbio系列几十G的数据量，ONT全长转录组如何选择数据量呢？各个物种的基因组大小从Mb到Gb不等，然而，其转录组大小都是在Mb水平。因此转录组数据量的选择不会特别受物种影响。当选择2G数据量时，对于二倍体来说，除极低丰度表达基因未达到饱和外，其他表达水平的基因均可以测得饱和，这与二代的6G数据饱和度相似。而对于多倍体生物，尤其是异源多倍体生物，若想让数据达到饱和，则需要加大数据量才能满足后续分析要求，实测数据饱和评估图如下。
Nanopore全长转录组测序可以直接定量是一大亮点，其定量的准确性值得我们探究。实测数据显示，无论2G、4G还是6G的数据量，其基因层面表达量的相关性均在0.999以上，这表明从2G开始，定量结果不会随着数据量的增加而发生变化。同时ONT平台和Illumina平台在基因表达量上也具有高度的相关性，相关系数大于0.8。因此，Nanopore全长转录组定量结果是可靠的，而且是基因水平定量 + 转录本水平定量同时提供。
Nanopore全长转录组最受瞩目的问题之一就是全长率，若是全长率很低，那所谓的全长转录组就失去了意义。百迈客在不断优化后，将平均全长率提升到了80%，较高的全长率大大提高了测序数据的有效性、完整性，后续结果更准确，可靠。基于较高的全长率，现有项目的基因组比对率在80%以上，大部分项目达到99%+。
Nanopore全长转录组作为第三代测序技术，在可变剪接事件鉴定方面有绝对优势，实测数据显示检测到了大量的新基因和新转录本，即便是研究非常深入的物种人中，也有2098个新基因，40029个新转录本。对于研究不是特别深入的物种来说，极大的完善了基因组注释，全长序列信息也为后续的基因克隆等分子实验，遗传学实验提供参考信息。老物种，新花样，新基因和新转录本值得深挖。下一期我们将全面展示ONT技术在新转录本数量和可变剪接方面的突破。
百迈客作为国内高通量测序领域的领先者，为了让更多用户受益于三代测序，已与牛津纳米孔公司（简称ONT）达成长期合作，为用户提供更丰富优质服务。目前实验室内Nanopore平台仪器除了MinION、GridION X5、PromethION Beta以外，还配备了三台PromethION 48测序仪！百迈客是目前国内ONT全长转录组平台最完善，通量最高的公司！* 专业测序资质：中国大陆唯一通过 PromethION/GridION 双平台 DNA/RNA 全种类样本认证的公司，并且是大陆首批推出ONT全长转录组测序的公司。* 专业技术团队：依托于高学历研发团队和10年测序行业的项目经验，ONT全长转录组已经已经检测过人、鼠、鸡、牛、羊、猪、拟南芥、小麦、茶树、水稻、玉米、辣椒、草莓、蛾、仿刺参、贝母、鱼、虾等物种，涉及模式动物，经济作物，蔬菜，水果，水产等多个领域。截止目前，已经有多篇成功案例预印发表，后续我们将持续推出成功案例的相关介绍。
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百迈客自2015年率先引进PacBio三代测序平台，2018年8月又与牛津纳米孔公司达成长期合作，拥有MinION、GridION X5和PromethION Beta/48多种型号全套纳米孔测序仪。全长转录组测序可利用Nanopore或Pacbio三代测序平台进行测序，借助其超长读长优势，无需组装，直接获得全长转录本，可准确鉴定基因的可变剪接、APA、融合基因、基因家族和非编码RNA等信息。百迈客至今已积累了丰富的项目经验，全长转录组合作文章先后发表在《Plant Biotechnology Journal》、《Biotechnology for Biofuels》、《Journal of Hazardous Materials》、《BMC Genomics》和《Fish & Shellfish Immunology》等国际知名期刊，据不完全统计，百迈客三代全长转录组成功案例累计发表17篇，是国内发表全长转录组成功案例最多的公司，已发表文章研究物种覆盖林木、作物、蔬菜、中药、水果、哺乳动物、昆虫和水产等领域，高精尖一流技术团队，助力累累科研硕果。