Fundamental Research | 杨运桂、黄旲研究员：RNA甲基化m5C调控液-液相分离

Fundamental Research 2022年第2卷第1期封面

RNA甲基化m⁵C调控液-液相分离

关键词：m⁵C，YBX2，相分离，RNA甲基化，表观转录组

5-甲基胞嘧啶（m⁵C）是高等真核生物信使RNA（mRNA）最常见的内部修饰之一。RNA甲基转移酶NSUN2催化m⁵C形成。ALYREF和YBX1特异性结合RNA m⁵C，分别调控mRNA的出核和稳定性。YBX2是YBX家族中除YBX1之外的另一种蛋白质，在小鼠睾丸中特异性表达。本研究结合RNA共沉淀技术和质谱（MS）技术，发现小鼠睾丸中的YBX2倾向于结合m⁵C修饰的RNA寡核苷酸。液相色谱-串联质谱（LC-MS）和RNA BisSeq数据分析进一步表明，YBX2与m⁵C修饰的RNA具有高结合亲和力。而在NSUN2敲除（KO）Hela细胞中，YBX2结合RNA的亲和力显著降低，证实YBX2是一种新的RNA m⁵C结合蛋白。

此外，等温滴定量热法（ITC）和晶体结构分析表明，人YBX2通过关键色氨酸残基W100的 π-π 相互作用识别m⁵C修饰的mRNAs。电泳迁移率转移分析（EMSA）表明，W100突变为苯丙氨酸（F）导致残基疏水性降低，从而显著降低与m⁵C的结合，表明W100是识别m⁵C的关键残基。

RNA结合蛋白（RBP）通过液-液分离（LLPS）在生物过程中发挥作用。本研究中的荧光显微镜和差分干涉对比（DIC）显微镜图像首次显示，YBX2可以在1μM的浓度下形成液滴，其大小在不同的蛋白质或NaCl浓度下发生变化。光漂白（FRAP）分析后的荧光恢复和微小液滴经过一定时间后，合并形成较大液滴，均表明YBX2具有液滴特征。

进一步研究发现，与生化分析结果一致，YBX2 W101F突变体和W101F/Y174F双突变体破坏了其对m⁵C修饰的结合偏好，有效地减弱了YBX2和m⁵C修饰RNA复合物的液-液分离，证明了m⁵C识别在YBX2液滴形成中的重要性。在野生型（WT）和NSUN2 KO细胞中对GFP标记的YBX2相分离进行的体内实验也表明，在缺乏m⁵C的情况下，YBX2在相分离方面存在缺陷，从而阐明了m⁵C修饰在YBX2相分离中的关键作用。 

本研究发现了RNA m⁵C甲基化调控相分离作用机制（图1），结合前期其他实验室团队发现的小鼠睾丸YBX2的丰富和动态表达，提示YBX2-相分离在精子发生和男性不育中的潜在临床应用。

图1. RNA甲基化m⁵C调控YBX2依赖的液-液相分离。

以上内容节选自期刊Fundamental Research 2022年第1期发表的文章“X. Wang, M. Wang, X. Dai, et al., RNA 5-methylcytosine regulates YBX2-dependent liquid-liquid phase separation, Fundamental Research 2(1)(2022) 48-55”。

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主要作者简介

杨运桂  中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）研究员。研究方向包括聚焦动态RNA甲基化修饰特征及规律，解析表观转录组学的功能调控和生物学意义。

黄  旲  上海交通大学附属新华医院研究员。研究方向包括表观遗传修饰结构生物学机制和规律，非编码小RNA生成、加工、调控以及疾病相关的RNA相分离。

王秀芝  中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）博士。

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