扩增子分析解读1质控,实验设计,双端序列合并
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写在前面
之前发布的《扩增子图表解读》系列，相信很多朋友都看过了(链接直达7月文章目录)。
这些内容的初衷是写给刚进实验室的学生读，加速大家对同行文章的解读能力。如果连同行的结果都看不懂，何谈对数据的理解，对科学问题的解释。希望刚入行的小伙伴多读高水平文章，配合我的解读，定能让理解上升一个层次。
之前説过的，此系列只要阅读过万，留言过百即分析纯干货《扩增子分析解读》。结果本公众号开通1个月，阅读量居然已经破7万了，昨天的月总结文章目录单日阅读6359次。原本以我为个人的公众号，还只是宏基因组这个小领域，能有500人关注就满足了，结果1个月关注人数已经1600+。
现在微信平台的影响力真是大强大了，我的文章原文在CSDN上仅只有7000+的阅读，不及公众号的十分之一；而科学网的博客阅读量也只有16000+。但它们是用来被搜索就引擎找到，方便在网上查询问题答案的人阅读。百度搜索“刘永鑫的博客”，第一个结果就是我的CSDN，这里的文章要比公众号发布的更早，非宏基因组相关技术文章也会发布在这里。而且这里内容可以随时修改，很多教程有更新可以来这里阅读。
本系列课程介绍
扩增子分析是目前宏基因组研究中最常用的技术，由于微生物组受环境影响大，实验间重复较差，更需要更多的实验重复和分析技术来保证结果的准确性、可重复性。
本系统文章叫分析解读，即有详细的分析代码和参数，又有本人对这些参数意义的解读，可以让大部分人零基础的人，更好的理解数据分析过程，并可亲实践在自己的课题上，获得更好、更合理的实验结果。
本文采用目前最主流的扩增子测序数据类型HiSeq2500 PE250类型数据为例，结合目前主流方法QIIME+USearch定制的分析流程。本课程中所需的测序数据、实验设计；和课程分析生成的中间文件，均可以直去百度云下载。链接：http://pan.baidu.com/s/1hs1PXcw 密码：y33d。
本课程代码的运行，至少需要Linux平台+安装QIIME1.9.1，我发布过三种安装QIIME的方法详见文章目录，总有一款适合你。
第一节. 质控,实验设计,双端序列合并
分析前准备
# 建立工作目录并进入,-p参数为如果文件夹存在不报错
mkdir -p example_PE250
cd example_PE250
# 建临时文件和结果子目录
mkdir -p temp result1. 测序数据文件
16S扩增子测序数据主要来自HiSeq2500产出的双端各250 bp (PE250)数据，因为读长长且价格便宜(性价比高)。HiSeqX PE150和MiSeq PE300也比较常见，但PE150过短分辨率低，而PE300价格高且末端序列质量过低。此外454在之前研究较但设备已经停产，PacBio读长长可直接测序16S全长1.5kb代表未来的趋势。
测序公司通常会返回raw data和clean data两种数据，raw data为测序获得的原始数据，而clean data则为去除含有接头序列及测序不确定N比例较高的结果，通常直接采用clean data进行质量评估及后续分析。
质量评估常用fastqc，一般测序结果文件会附带评估报告，质量太差会重测，此步非用户必须。
大家百度云下载我准备的两个数据文件PE250_1.fq.gz和PE250_1.fq.gz至工作目录，一共600M，包括2,500,000条fastq格式的双端250bp数据。(提示：可以在Windows上下载，使用filezilla等工具上传服务器)
安装fastqc，己安装请跳过
# 下载fastqc http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/download.html#fastqc
wget http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.11.5.zip
# 解压fastqc
unzip fastqc_v0.11.5.zip
# 赋与fastqc可执行权限
chmod 755 FastQC/fastqc
# 运行
./FastQC/fastqc -t 2 *.fq.gz如果系统中己安装过fastqc可直接运行fastqc -t 2 *.fq.gz即可。-t为设置线程数，建议与数据文件数量相同最佳，可以提高评估速度，*.fq.gz为输入文件，可以用*通配符指定多个文件。
运行结果每个数据每件会生成两个文件，如下。
PE250_1_fastqc.html # 网页评估报告
PE250_1_fastqc.zip # 网页报告相关文本和图片压缩包html文件可以用firefox PE250_1_fastqc.html直接查看(需要终端配置Xming/Xmanager)，或下载本地浏览器打开阅读；zip文件为评估结果的表格和图片，方便解压后使用。
数据质量如下：上为左端1-250质量；下为右端1-250质量分布箱线图
我们可以看到左端的质量比较高(图中绿、黄、红区域分别代表质量优、良、差)；右端序列末端质量较质，且箱体也进入红色差区，但中位数红线位于绿色高质量区。这样的结果已经算是中等偏上的了，在PE250测序中，右端的尾部质量都下降很严重，但只要左端的末端较好即可，双端序列合并可进行校正，一般都可以放心使用。
2. 实验设计文件
在QIIME中，把实验设计文件叫mappingfile，大家下载mappingfile.txt文件；自己的实验一定要按照示例的格式模仿填写，如错误后续无法运行。QIIME自带了个工具，可以检验文件书写是否正确。
# 验证实验设计是否有错误
validate_mapping_file.py -m mappingfile.txt运行结果会输出三个文件
mappingfile_corrected.txt # 自动修正的实验设计，小错误会自动修改，但末必符合你的要求，不建议直接使用
mappingfile.html # 结果的错误报告，可下载查看网页，会高亮显示错误的位置
mappingfile.log # 运行结果报告运行结果无误会显示 “No errors or warnings were found in mapping file.”。有错误建议查看生网页报告，高亮有错误的地方，自行修改后重新检测，直到无误。更多说明建议阅读帮助 http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html
3. 双端序列合并
我们首先的任务是把双端序列合并，根据两端序列末端的互补配对，可以合变为我们扩增区域的序列，同时还可以对重叠区的质量进行校正，保留最高测序质量的碱基结果。使用join_paired_ends.py脚本，合并两个文件为单个。f/r参数为输入左和右端序列，支持压缩格式*.gz；m是选择方法，默认为fastq-join就可以了，也可以选择seqprep，更好但更慢；o为输出文件目录。更多说明建议阅读帮助 http://qiime.org/scripts/join_paired_ends.html
# 双端序列合并
join_paired_ends.py -f PE250_1.fq.gz -r PE250_2.fq.gz -m fastq-join -o temp/PE250_join序列合并完，我们会在设置的输出目录temp/PE250_join看到3个文件，如下：
fastqjoin.join.fastq # 合并成功的序列
fastqjoin.un1.fastq # 左端末合并成功的序列
fastqjoin.un2.fastq # 左端末合并成功的序列我们下游分析通常只对fastqjoin.join.fastq进行操作。
写在后面
本文已经讲了三个程序的使用，要想了解这些程序的更多功能，一定要阅读程序的帮助全文，才能有更深入的理解。
下节预告：扩增子分析解读1提取barcode, 样品拆分及质控, 切除扩增引物
Reference
http://qiime.org/scripts/index.html
http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html
http://qiime.org/scripts/join_paired_ends.html
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