AAV递送新途径：当细胞外囊泡遇到AAV

基因治疗是当前重要的生物医药研发方向，目前有多种疾病的治疗正在进行基因治疗临床试验，已有多种基于病毒载体的药物获得了美国食品和药物管理局（FDA）的批准。基因治疗不仅用于罕见的单基因遗传性心肌病，还用于其他常见的疾病，如糖尿病和心力衰竭。目前用于治疗心力衰竭的药物只能控制症状和疾病，但不能治愈。相比之下，基因治疗具有纠正潜在缺陷和病理以及介导心肌细胞（CM）功能长期改善的潜力。目前心肌基因治疗普遍使用具有非致病性、稀有整合和长期高转基因表达水平的腺相关病毒（AAV）。而且重组AAV在转导后大部分作为游离体能够存在长达24个月，这表明AAV非常适合慢性心力衰竭治疗。

虽然系统性地递送AAV来干预心脏细胞的基因表达的分子机制简单，但实现临床应用的道路是艰辛的。一个主要障碍是中和抗体（NAbs）的存在，这些抗体在自然暴露于AAV环境或AAV给药后形成。来自临床研究的数据表明，即使在相对低的滴度下，AAV NAbs也会阻止基因转导并减少或抵消治疗效果。AAV的NAbs随着年龄的增长而增加，并且在所有研究人群中都很常见。患者中预先存在的AAV NAbs阻碍了基于AAV的基因治疗的效率，并限制了符合基因治疗试验入组标准的患者数量。在最近一项关于AAV1 /肌浆网钙ATP酶2a（AAV1 / SERCA2a）基因治疗的临床研究中，发现在1552名心力衰竭患者中，59.5％的患者存在AAV1 NAbs。在另一项研究中，高剂量免疫抑制并未防止小型猪中AAV1 NAb的形成。由于患者可能需要> 1次病毒基因治疗处理，因此需要采取策略来规避NAbs。

细胞外囊泡（EV）是膜结合囊泡，能够携带来自不同细胞类型的生物分子，例如脂质，蛋白质和RNA。最近的研究表明，EV还可携带多种类型的病毒，包括肝炎，HIV和AAV，并保护这些病毒免受抗体介导的中和作用。通过EV载体来包裹AAV（EV封装AAV [EV-AAV]）是规避基于AAV的基因治疗中NAbs中和的潜在方法。EV的膜结构可以保护AAV免受NAbs的影响，因此EV-AAV可以呈现更高的NAbs抵抗力。目前的研究表明，生产 AAV载体的HEK293T细胞自然分泌的大型和小型EV可以在小鼠视网膜、内耳、肝脏和神经系统中携带并传递完整的AAV。

生产中，AAV颗粒会和EV-AAV一起分泌到细胞的调节培养基中。在EV-AAV制备中的AAV可能会降低EV-AAV的有效剂量和NAbs抵抗力，并导致更高水平的AAV引起的不良反应。有效地从EV-AAV中去除AAV污染物是其临床转化的关键第一步。前期使用神经病毒型AAV血清型1、8和6纯化EV-AAV的结果表明，其NAbs抵抗力有限，可能就是由于与AAV不充分的分离有关。

近期，国际顶尖心血管领域杂志Circulation上的一篇文章评估了使用标准AAV载体和EV-AAV介导到心脏的基因递送和治疗效果。该研究：（1）优化了基于超速离心的EV-AAV纯化策略，成功的从生产AAV的HEK293T细胞调节培养基中分离到高度纯净的EV-AAV，尽可能的降低AAV潜在污染；（2）全面表征了EV-AAV的大小、纯度、浓度、形态、EV标记蛋白质以及分子含量；（3）评估了在人类左心室CM和人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生CM以及小鼠心脏中，使用心肌病毒型AAV血清型6和9和几个报告构建物的基因递送效果和NAbs抵抗力；（4）验证了EV-AAV与AAV介导的SERCA2a基因在预免疫小鼠心肌梗死（MI）临床前模型中的递送和治疗效果；（5）在小鼠心脏内和体外人类CM中探索了EV-AAV细胞内运输的机制。通过使用5种不同的体外和体内模型系统，该报道发现并建立了一种基于AAV的心脏基因治疗临床新策略。

图1. 基于密度梯度超速离心的纯化工艺成功富集了EV-AAV：A， EV-AAV的分离、表征、功能、趋向性和摄取机制示意图。B，碘克沙醇密度梯度超速离心后得到的12个组分的密度。C, 12个组分的Western blot分析。等体积的组分进行SDS-PAGE凝胶电泳，并用Alix、Flot1、Tsg 101、Gm130和Cyc1对膜进行印迹。D, Western blot定量测定12个组分中Alix相对表达的百分比。E，用定量聚合酶链式反应测定12个组分中的AAV基因组。F和G，纳米流式细胞术分析和定量12个组分的载体跨膜蛋白，包括CD63, CD81和CD9。使用平均等效荧光染料值(MESF)校准每个组分的MESF荧光强度。除Fr3和Fr4组分外，EV-AAV与其他污染物分离良好，其余组分未检测到MESF值。H、可调式阻性脉冲感应(TRPS)-qNano分析Fr3和Fr4测量EV-AAV尺寸。

图2. EV-AAV、EV-WT与AAV的电镜照片。

图3. 在心肌梗死（MI）临床前小鼠模型中，在AAV中和抗体（NAb）存在的情况下，EV-AAV仍然能介导的SERCA2a基因递送，并显著改善心脏功能。A、模型示意图。B，超声心动图评估左心室的射血分数功能 (EF; %)。C，在心肌梗死(MI) 6周后的抗体(NAb)阴性和NAb阳性小鼠(每只小鼠1 mg NAb) 中使用等滴度的EV-AAV 9 - SERCA2a、AAV9-SERCA2a、AAV9-SERCA2a或生理盐水(1e11vgs注射量) 后的分数缩短情况(FS; %)。D，代表性的M模式超声心动图显示NAb -和NAb+小鼠心肌梗死后6周左室壁前后运动。心肌梗死后2周至6周的EF (E)趋势线和FS (F) 趋势线。

图4. 该研究结果模式图。游离腺相关病毒(AAV)与阻断AAV进入细胞的中和抗体结合。细胞外囊泡包裹的AAV (EV-AAV)保护AAV免受这种中和作用，从而改善基因向心肌细胞的递送效果。在细胞质中，EV-AAV被吸收到酸性亚细胞器中，如晚期内质体和溶酶体，它们可以将AAV从EV-AAV中释放出来，从而使AAV顺利入核，然后进行基因表达。

细胞外囊泡/外泌体包裹AAV是当前产业界研发的重点方向之一。总的来说，该研究证实了EV-AAVs完全具有感染性，能够抵抗抗体介导的中和作用，并且能够有效地转导至心肌处。该研究提供了一种全新的策略，通过规避NAb中和作用来改善基因治疗效果，而这正是以往AAV治疗领域的障碍之一。这些发现将为基于AAV的基因疗法治疗心力衰竭患者开辟了新途径。总之，该研究将对未来的基因治疗临床试验产生积极影响，并有可能推进基于AAV的治疗方法用于治疗心血管疾病。

实验方法：

1. EV-WT和EV-AAV纯化：差速离心

在转染质粒后的第三天，从HEK293T的细胞培养基中分离出EV-AAVs。简而言之，通过500 g离心10分钟和2000 g离心20分钟去除细胞和细胞碎片。接下来，通过12000 g离心30分钟去除较大的细胞外囊泡（凋亡体和微囊泡）。离心后的上清液在Optima L-90K超速离心机（Beckman Coulter）中使用Type 70Ti转子在120000 g条件下离心90分钟。EV沉淀物在0.22 µm过滤的PBS中重悬。

2. EV-WT和EV-AAV纯化：碘克沙醇密度梯度离心

通过碘克沙醇梯度液超速离心（碘克沙醇梯度液包含5 mL 25％碘克沙醇、3 mL 40％和1 mL 60％碘克沙醇与3 mL EV样品）。在SW41Ti转子（Beckman Coulter）中以190000 g离心3小时，使用Ultra-clear离心管（Beckman Coulter）进行进一步的纯化步骤。离心后，从密度梯度液顶部开始逐一收集组分，每个组分1 mL，并将每个组分在PBS中稀释10倍，并使用SW41Ti转子以120000 g离心90分钟，然后将所得沉淀物重悬于PBS中。使用Abbe折射计测定了每个组分的密度。所有离心均在4°C下进行。超速离心步骤提供的相对离心力均为平均相对离心力。使用与EV-AAV相同的纯化过程从未转染的HEK293T细胞培养基中分离出野生型EVs（EV-WT）。

Tips:如果希望更轻松对梯度液进行收集，可以选用贝克曼馏分回收器，同时能够获得纯度更高的样品。

Li X, La Salvia S, Liang Y, Adamiak M, Kohlbrenner E, Jeong D, Chepurko E, Ceholski D, Lopez-Gordo E, Yoon S, Mathiyalagan P, Agarwal N, Jha D, Lodha S, Daaboul G, Phan A, Raisinghani N, Zhang S, Zangi L, Gonzalez Kozlova E, Dubois N, Dogra N, Hajjar RJ, Sahoo S. Extracellular Vesicle-Encapsulated AAVs for Therapeutic Gene Delivery to the Heart. Circulation. 2023 Jul 6. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.122.063759. PMID: 37409482.