加速病毒载体疫苗开发的新兴策略

目前，大多数经监管机构批准的疫苗是减毒活疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗，其可为人类提供针对多种病原体的免疫接种。然而，即使经过数十年的严格研究和开发，仍有许多传染病没有可用的获批疫苗。导致这种发展阻碍的一些主要因素包括不同病毒的个体特性、评估在某些人群中保护性和安全性的动物模型的不足以及使其对制药公司缺乏吸引力的高昂成本。此外，传统的疫苗技术可能根本无法针对其中一些更具挑战性的病原体产生可接受的结果，因此，必须开发新的方法。

其中一种这样的新方法是病毒载体疫苗。尽管病毒载体疫苗方法尚未在人类疫苗中广泛普及，但使用病毒作为载体的想法并不新鲜，自80年代首次发表了病毒载体疫苗的概念验证后，已经开发了多种用于动物的病毒载体疫苗，但其在人类中的使用并没有这么快流行起来，部分原因是更高的监管标准以及安全问题。目前，已有少数几种病毒载体疫苗被至少一个国家或地区的监管机构批准使用，包括针对埃博拉病毒的疫苗rVSV-ZEBOV和Zabdeno/Mvabea，前者是迄今为止唯一获得批准的具有复制能力的病毒载体疫苗，以及4种针对 SARS-CoV-2的疫苗：Oxford-AstraZeneca和Janssen的疫苗以及Sputnik V和康希诺的Convidecia，其均为非复制型⁽³⁾。

病毒载体疫苗的主要应用是新兴传染病和传统疫苗接种策略迄今为止无法可靠预防的传染病。目前疫苗供应有限或没有相应可用疫苗的疾病/病原体包括艾滋病毒/艾滋病、丙型肝炎(HCV)、疟疾、肺结核、呼吸道合胞病毒 (RSV)、巨细胞病毒 (CMV) 等。

病毒载体疫苗可以以多种不同的方式进行分类，例如所使用的病毒家族或种类、靶向细胞类型、它们被设计用来防御的病原体类别等等。病毒载体通常分为两大类，复制缺陷型（RD）和复制完整型（RC）。在这两种情况下，载体将充当基因疫苗，因为它们能够感染并进行病毒复制或通过转导将遗传物质引入宿主细胞。由于病毒载体疫苗使用与野生型病毒相同的机制将遗传物质递送给细胞，其通常都被认为是“活”疫苗。

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许多病毒具有用作载体的潜力，并且每个病毒家族都有自己的优点和缺点。一些最常用的病毒包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、痘病毒和弹状病毒科病毒。逆转录病毒和慢病毒具有较大的包装容量、良好的整合能力，可以转导非分裂和分裂细胞，并且可以相当容易地进行假型化，但是，这些载体的插入诱变存在一些问题。腺病毒载体具有广泛的趋向性，显示出强基因表达，并且由于低致病性，通常非常安全，但针对人类腺病毒株的预先存在的抗体的血清阳性率非常高。目前所有基于病毒载体的 SARS-CoV-2 疫苗和 Zabdeno/Mvabea 埃博拉病毒疫苗的第一剂 Zabdeno 均基于腺病毒平台。痘病毒载体显示出高免疫原性并且能够在培养中可靠地产生，但预先存在的抗体的血清阳性率很高。Zabdeno/Mvabea 埃博拉疫苗的第二剂 Mvabea 使用改良的Ankara痘苗病毒载体。基于弹状病毒的载体可诱导强烈的体液免疫反应，易于假型化，现有抗体的血清阳性率较低，但某些病毒种类包含神经毒力的可能性。rVSV-ZEBOV 是一种重组的、具有复制能力的改良水泡性口炎病毒 (VSV)，是弹状病毒家族的成员，可表达Zaire埃博拉病毒表面糖蛋白

生产病毒载体疫苗最常用的细胞系是人胚肾 (HEK) 293 细胞。HEK293 细胞因其易于培养、快速繁殖、对多种转染方法的耐受性和高效的蛋白质生产而成为一种方便的选择。HEK293 细胞有多种变体可用于生物制药生产，包括 HEK-293H、HEK-293T 和 HEK-293EBNA1。对于病毒和病毒载体的生产，通常使用 HEK-293T 细胞。另一种常用的细胞系是 Vero 细胞。Vero 细胞系于60年代构建，使用其进行病毒疫苗生产的丰富经验以及各种病毒的高生产率，使 Vero 细胞成为生产培养极具吸引力的选择。用于生产病毒载体疫苗的细胞系选择将取决于所使用的载体平台，因为某些病毒在一种细胞系中比另一种细胞系中可更快地达到足够滴度。尽管有多种合适的选择，但基于细胞培养的载体生产仍然是病毒载体疫苗成本和生产速度的主要限制因素，进一步优化对于这些疫苗的广泛应用至关重要。

在生产细胞中生产临床级病毒需要上游和下游的生产工艺，这些工艺过程通常昂贵、耗时，有时缺乏可放大性。特别是在腺病毒载体的情况下，一个限制因素是必须在哺乳动物细胞系上培养载体。在 2020 年 COVID-19 大流行之前，腺病毒载体的生产规模尚未达到有效应对大流行的规模。确切的生产过程将根据所使用的载体类型而有所不同，但是它们应该在专门研究特定载体平台的设施中保持相对一致。

另一方面，可以改进病毒载体疫苗生产方法，以提高生产效率。这可以通过提高产量、开发标准化的生产和纯化工艺以及开发大规模生产的方法来实现。载体生产的一般过程从开发所需载体开始，扩增该载体，然后收获载体，用于下游工艺处理。

对于传统贴壁细胞，基于塑料培养容器的技术仅限于规模扩展，在应对更高产量需求时，需要显著的时间、空间以及人力的投入，固定床生物反应器是一个可放大的选择，但对于每年需要供应全球数亿剂疫苗的应用，如针对 SARS-CoV-2的疫苗，仍非最佳选择。基于搅拌罐生物反应器的悬浮驯化细胞培养是需大规模商业化生产的疫苗产品最契合的技术，特别是当结合灌流培养，以实现培养强化时，Oxford-AstraZeneca团队已报道了此类平台的构建，以及其如何加速疫苗的开发和生产^（2）。此外，为了优化产量，需要考虑 3 个主要因素：感染时的感染复数（MOI）、病毒颗粒在生物反应器中停留的时间以及培养基中细胞的浓度和代谢状态。换句话说，该过程必须优化活细胞与感染性颗粒的比例、产生最大载体滴度的收获时间，以及所用细胞培养的健康程度和营养供应。

下游工艺是个多步骤过程，其中收集的载体被纯化，最常见的是通过深层过滤澄清、切向流过滤 (TFF)、至少一步层析（如阴离子交换 (AEX)）以及另一个 TFF 步骤。下游工艺的复杂性通常被认为不利于针对新出现的病原体的响应。生产费用是在全球范围内提高病毒载体疫苗功效的另一个重要因素。由于资源贫乏地区的疾病负担过重，因此确保低成本的生产和使用大多数地点的标准设备的能力至关重要。最近，有研究团队着手为腺病毒载体制定大规模生产战略，使其更具成本效益、可快速生产大批量、全球可用性以及始终如一的高质量。开发的模型通过利用已经广泛使用的设备和材料实现了低成本。此外，他们简化了下游工艺，通过将澄清的裂解液直接上样到 AEX 证明了纯化载体的高效回收。结合这些改进，能够将先前公布的批次或补料分批工艺的生产率提高近一倍，同时可将每剂的最终价格保持在较低水平^（1）。

与其它药物类似，病毒载体疫苗的生产必须符合现行良好生产规范 (cGMP) 规定。因此，对重组载体进行广泛的质量控制和表征是生产安全、纯化且有效的病毒载体疫苗的必要条件。

病毒载体疫苗可以改进的另一个领域是规避预先存在的针对载体的中和抗体。这在考虑基于腺病毒和腺相关病毒的载体平台时最为重要，根据病毒的血清型和人口统计数据，这些平台可以携带相对较高的血清流行率。一种方法是通过基因或化学工程对载体衣壳进行修饰。对病毒外壳进行基因修饰有两个主要应用：逃避免疫防御和增强对特定细胞类型或组织的趋向性。修饰载体以逃避免疫反应的另一种方法是通过化学屏蔽。这种方法有效地将载体“盖”在一层化学涂层中，以防止先天性和适应性免疫细胞不必要的识别。

病毒载体疫苗是一种很有前途的现代免疫方法，正在成为开发针对新出现和挑战性病原体的疫苗的重要工具。目前病毒载体疫苗的某些方面仍受到限制，包括中和抗体对常用载体的血清阳性率、生产工艺限制和安全问题。这里提到的潜在改进措施只是提高病毒载体疫苗大规模使用可行性的几个可能方向。这些和其它新技术和改进的进一步开发和应用将加强病毒载体疫苗用于新兴病原体和传统疫苗方法无法开发有效疫苗的病原体的前景。

参考文献：

1. C.C.D.Joe, et al., Manufacturing a chimpanzee adenovirus‐vectored SARS‐CoV‐2 vaccine to meet global needs. Biotechnology and Bioengineering, 2021, 119, 48-58.
2. C.C.D.Joe, et al., Accelerating manufacturing to enable large-scale supply of a new adenovirus-vectored vaccine within 100 days. bioRxiv, 2021.
3. J.Marks, A Review of Virus-Vectored Vaccines: Current Production Methods, Uses, Issues, and Future Perspectives. Biology and Microbiology Graduate Students Plan B Research Projects, 2022, 35.