基因治疗新曙光，CRISPR实现高效率点突变修复技术
来源：百家号
目前的基因组编辑技术通过引入DNA位点的双链断裂，进而通过同源重组实现基因的修复，然而很多基因遗传病多是由于点突变引起，通过同源重组修复的方法非常低效而且会在切割位置随机丢失或者插入一些碱基，从而引起基因的失活。为了避免DNA的切割引起的危险，科学家们开发了一套 碱基编辑技术。
这套技术并不需要切割DNA，可以实现直接和可逆的DNA碱基的替换。
胞嘧啶的去氨基反应是由胞嘧啶脱氨酶实现，导致形成一个尿嘧啶。而尿嘧啶可以通过与T，胸腺嘧啶配对，从而实现碱基替换。
目前已知的很多脱氨酶主要是作用于RNA，不过可以找到一些非常少的脱氨酶可以作用于ssDNA，最近的研究表明，在cas9解旋DNA的过程中，guide RNA与target链配对，而被置换的DNA链，人们发现形成一个R loop，从而有利于脱氨酶进行结合。
#第一代碱基编辑技术#首先，科学家们，探究了四种已知的作用于ssDNA的胞嘧啶脱氨酶，(人AID基因，人的APOBEC3G基因，兔 APOBEC1基因和鳗鱼的CDA1基因)，在四种脱氨酶中，兔的APOBEC1展现最高的活性。
科学家们发现，APOBEC1融合到cas9的N端而不是C段可以发挥作用，同时科学家们探究了cas9和APOBEC1之间linker长度对于不同的替换位点的选择性。
在体外实验中，科学家们，发现脱氨酶有很高的活性，当不同的linker长度增加时，脱氨酶的窗口期也从3个碱基增加到6个碱基。并且发现XTENlinker作用最好，科学家们，将APOBEC1 -XTEN-dcas9命名为第一代碱基编辑器。
#第二代碱基编辑技术#为了评估不同周围碱基对于要编辑碱基位置的影响，科学家们，使用体外实验，对于不同位置进行了探究：
不同于体外实验，细胞内的碱基编辑手段，由于存在内源的基因组修复机制，而可能产生不同的效率，科学家们选择了14个基因组中的位置，尝试进行碱基替换，尽管都可以实现高效的编辑，但是编辑的效率从0.8%-7.7%，与体外活性相比降低了5-36倍。
科学家们猜测可能体内的U：GDNA修复机制可能参与这个过程，降低碱基编辑的效率。尿嘧啶DNA糖基化转移酶催化去除DNA中的U，起始碱基切除修复，将U:G恢复成C:G，在噬菌体中发现的糖基化转移酶抑制剂UGI，可以阻断UDG的活性，这是一个84个残基组成的蛋白。科学家们，将UGI连接到BE1的末端，从而实现第二代碱基编辑.可以看到相关活性开始显著提高。
更令人惊喜的是，第一代和第二代碱基编辑技术，对于基因组的损伤微乎其微，低达0.1%。
不过，第一代和第二代技术最多也只能实现50%的修复效率。为了突破这个瓶颈，科学家猜想，可以通过在模版链中引入切口，进一步激活错误修复机制，去除模版链，重新合成，从而实现更高的活性。
最终科学家们发现可以有37%的细胞产生了相应的修复。最后，科学家们，探究利用第三代碱基修复技术修复两种常见的疾病相关突变。使用高通量测序技术，科学家们，发现实现了58-75%的修复效率。
相关文章推荐：