AAV基因治疗项目的转染最佳实践
本文节选自《Transfection Best Practices for AAV Gene Therapy Programs》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。文中观点仅代表原文和受访者。
随着病毒载体继续将基因治疗创新推向市场，许多研究人员将目光投向了转染的优化，即将纠正性遗传物质注入细胞的过程。这不仅仅是如何转染它们的问题，还包括如何高效且大量地进行转染。适用于一种细胞系的方法可能不会完美适用于其它细胞系，而且转染方案在临床试验生产过程中对可放大性和成本有不同的影响。
出于这些和其它原因，当被问及基于腺相关病毒(AAV)的基因治疗方案的最佳转染策略时，专家通常回答:“这要看情况。”作为康宁生命科学高级生物工艺应用科学家，AnnRossi Bilodeau经常收到研究人员关于他们应该采用哪种方法的问题：他们应该使用悬浮细胞培养系统还是贴壁细胞培养系统? 一种转染试剂比另一种更可取吗? 转染过程应该运行多长时间? Bilodeau解释说，使用哪种策略“在很大程度上取决于你最终想要达到的目标，而不是只有一种正确或错误的方法。从细胞系到平台、工厂和各个研究人员，许多因素都可以影响转染 - 应该优化一个工艺，以将所有这些因素纳入考量。”然而，正如Bilodeau和试剂供应商Polyplus-transfection在这里所证明的那样，最佳实践值得探索。
用于病毒载体的转染方法
转染的主要问题是如何进行。基于AAV的基因治疗研究一般依赖于化学介导的转染。与电转和微量注射等复杂且昂贵的工艺相比，化学转染易于使用，因此被认为是规模放大时成本效益更好的金标准。
Polyplus-transfection科学支持专家Cassie-Marie Peigné解释说:“大多数AAV疗法涉及人胚胎肾(HEK)293细胞，可以很容易地使用化学试剂转染。当专门针对病毒载体的生产而进行开发工作时，这种试剂在可重复性和稳健性方面是最好的，从而无需更昂贵的物理转染方法。”
平台和规模的考量
平台的选择会影响转染试剂的选择，但无论是贴壁培养系统还是悬浮培养系统，在效率方面都没有相比另一种方式的明显优势。这两种平台都与转染相容，而罐的选择更多地与细胞生长有关，而不是细胞转染。
Polyplus-transfection的科学交流专家Alengo Nyamay 'antu说:“优化贴壁细胞和悬浮细胞的转染需要时间。但重要的是你要进行优化。”
如果研究人员不确定选择哪个平台，Peigné建议考虑时间线和规模。“贴壁平台是快速获得良好滴度的传统方法，这种工艺已经在生产工厂中建立起来了。” 贴壁培养罐可能仅限于扩大扩展而不是规模放大，这可能会给人工和生产足迹带来挑战。但是，与单层容器相比，康宁CellSTACK、HYPERStack和CellCube等平台可以帮助提高产量，降低劳动力需求，特别是当配置为封闭系统时。虽然悬浮罐和转染试剂可以促进规模放大，但这种平台需要额外的时间来优化细胞活性和质量，特别是在处理驯化悬浮的细胞时。
请记住，规模是双向的 - 规模缩小可能与规模放大同样重要。Bilodeau说:“使用可放大的罐和转染试剂可以帮助你相对容易地跨越不同规模。如果您需要返回到小规模并进行优化，您可以在将工艺带到生产之前，在小规模条件下，进行‘故障排除’。通常，拥有一个明确表征的工艺比简单地最大化生产更重要。”
有意义的结果
病毒载体的转染可能是一项艰巨的任务，但它并不总是这样。为了有效地得出有意义的结果，研究人员需要知道成功和不成功的工艺的特征。Peigné指出了这样一个问题，即大家“倾向于假设转染效率与病毒滴度完全相关，但事实并非如此。如果你正在进行优化，那么你就应该在工艺的最后考虑病毒滴度的结果。”
研究人员也应该对寻求支持感到自在。Polyplus-transfection和康宁生命科学等供应商可以帮助科学家针对他们的目标选择正确的产品。Peigné表示:“如果你正在开始一个新工艺，联系供应商以确保平台、培养基、试剂和其它因素的最佳组合总是有帮助的。”供应商还可以帮助确定“你事先是否有按照正确的指南操作。知道去哪里找可以节省相当多的时间。”
关于转染的有用提示
管理融合：转染效率在很大程度上取决于细胞健康性。保持培养物在80-90%以下的融合度，定期传代，并对健康细胞进行转染 (如：早期传代，支原体阴性)。不要让细胞在传代前过度融合，因为接触抑制会减慢细胞生长，从而降低转染效率。
了解你的方案：遵循转染方案或使用指南。有时在转染前培养的接种密度和次数必须适应不同的细胞类型和应用，前提是细胞在转染时正在积极分裂。
减轻脱落：如果贴壁细胞因蛋白或病毒载体表达或毒性而从容器表面脱落，在转染前将细胞接种在特定表面可以增强附着。
优化试剂和原材料：确保只使用不含蛋白质、RNA和内毒素的高质量质粒制剂。
调整您工艺中质粒DNA的量以及试剂与DNA的比例，以提高其转染效率。
有时在转染后会发生细胞毒性现象。如果观察到毒性，那么降低你工艺中试剂与DNA的比例或使用的质粒DNA的量。(如果表达的蛋白质是有毒的，那么这样做尤其重要。) 转染4 ~ 6小时后，可能还需要更换培养基。
使用适合在有血清和抗生素存在的情况下进行转染的试剂。当使用无血清培养基时，要确保它允许转染。
原文:Ann Rossi Bilodeau, Alengo Nyamay'antu, Cassie-Marie Peigné, Transfection Best Practicesfor AAV Gene Therapy Programs. BioProcess International, 2021.
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