mRNA疫苗生产和工厂设计
本文节选自《mRNA Vaccine Production and Facility Design》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
现代疫苗
在过去的一年里，我们目睹了疫苗研究和生产活动的爆发式增长，原因是SARS-CoV-2。我们也看到了人们对一些虽然“晦涩”但却非常重要的技术的重视。这包括了各种疫苗类型和亚型，从外泌体包裹的AAV载体疫苗，到递送病毒抗原mRNA的脂质纳米颗粒。虽然传统的平台仍在使用，但创新的递送系统现在已包括完全合成的抗原结构、亚病毒颗粒和嵌合菌蜕（bacterialghost）。抗原生产平台可采用动物组织、无细胞表达、全植物、细胞培养和直接化学合成等多种方法。
即使将讨论局限在基于细胞的生产上，也会产生各种各样的平台，从大肠杆菌到酵母，从真菌到动物细胞。操作方法包括一次性使用(SU)、补料分批微载体和固定床连续系统。此外，由于过滤器和填料等部件会随着时间的推移而变化，因此获批的传统生产工艺也需要与时俱进。此外，我们看到许多不同类型的细胞产品正在被使用，如抗原蛋白、减毒或随后灭活的病毒、病毒样颗粒(VLP)、载体或递送包，如细胞外囊泡(EV)，以及细菌或细菌载体疫苗。
mRNA疫苗
mRNA疫苗是一种新型的、预防传染病和慢性病的疫苗。许多经典的疫苗将分离的天然抗原或重组抗原产品注入我们的体内，以引起免疫反应。但是mRNA疫苗可以让我们的细胞制造一种蛋白质 - 甚至只是蛋白质的一小部分 - 来触发免疫反应。例如，COVID-19 mRNA疫苗使用编码多种免疫原性表位的mRNA，这些表位是一种无害的COVID病毒成分，称为刺突蛋白。用聚合物或基于脂质纳米颗粒等载体将mRNA递送到我们的细胞中。在颗粒递送mRNA后，体内细胞的机制产生刺突蛋白抗原，然后分解mRNA。之后，细胞将蛋白质显示在其表面，我们的免疫系统将其识别为外来物，并对其建立免疫反应。本文将介绍生产过程的步骤，并确定在设计mRNA疫苗生产设施时的一些关键考虑事项。
mRNA疫苗生产
mRNA药物底物生产
mRNA疫苗的核苷酸部分可以通过四种不同的方法制备，包括1)化学合成，也就是说，在化学反应釜中合成，2)使用来自细菌质粒的线性化DNA模板，体外转录，3)使用PCR进行DNA模板扩增，以及4)以商用化双链DNA片段作为模板。对于基于DNA模板的体外转录 (IVT) 生产，使用核糖核苷酸和T7、T3或Sp6噬菌体DNA依赖的RNA聚合酶，该酶提供转录的所有因子(起始、延伸或终止)。在此，我们将重点介绍这种基于质粒模板的方法。
规模
因为mRNA疫苗是一种完全不同类型的产品，所以生产设备的数量和规模都较小。与生产基于鸡胚的疫苗甚至生产单克隆抗体的设施不同，完全商业化规模的mRNA疫苗生产工厂通常包含3到5个生产车间，其中一个车间支持5 - 50L生产发酵罐，用于生产质粒 (DNA模板)。
质粒的生产
通常，来自中央细胞库的冻存细胞复苏并在摇瓶中扩增，用于生产发酵罐接种。发酵罐内装有培养基，并接种烧瓶内容物。发酵过程需要1-2天。然后在发酵结束时将该培养液冷却，将收获的培养液离心，从培养基中分离出细胞 (其包含用于mRNA的质粒模板)。细胞裂解后，可通过深层过滤澄清收获液。再通过柱层析、酶解、超滤/洗滤以及最后的除菌过滤步骤，从澄清的裂解液中纯化出质粒DNA。
从质粒产生mRNA
然后将纯化后的质粒转移到反应罐中，包括来自缓冲液制备区的体外转录 (IVT) 试剂和酶，反应在数小时内完成。然后，质粒可以通过脱氧核糖核酸酶孵育在几分钟内被除去。淬火后的IVT产物进行浓缩、纯化，并通过层析和过滤处理。最后，对mRNA进行加帽反应，一般需要数小时，随后再进行纯化、缓冲液调节、稀释和除菌过滤。
药物底物制剂和原液灌装
制备一种递送系统，例如聚合物或基于脂质的纳米颗粒 (LNP)，然后使用不同制造商特有的方法，将纯化的mRNA包封在其中。所得到的mRNA/递送纳米颗粒装置经过浓缩、缓冲液置换和除菌过滤。然后进行最终评估，并依序装入袋子/瓶子当中，作为药物底物。药物底物通常在最终制剂和最终药物产品灌装前冷冻保存，在某些情况下采用冻干。
现代疫苗工厂
今天，工厂正在提供一个更高数字化或“4.0”的生产环境，实现多样化产品阵列的高产量和稳健生产。在高度自动化的工艺环境中，企业控制系统使技术转移更加容易，生产更加灵活。事实上，数字化技术现在已经整合到整个现代工厂当中，包括企业资源计划系统、电子生产记录、过程控制系统、数据历史记录以及实验室信息管理系统。这些数字平台简化了产品制造、检测和放行。它们还可实现稳健的数据管理，以支持工艺开发、表征和转移。
我们已经看到了在各个方面都有更广泛数字系统集成的工厂，包括采购、工艺、质量和分发系统等要素，提供更集成的制造和供应链。这将产生一个基于云的自动化系统，管理疫苗管线的规划和执行，从设计和规模放大，到生产和分发，再到产品上市后的监管监督。
在维持GMP方法、设施和控制要求的同时，还有新的设计提供额外的价值。它们是许多进步技术的共同成果，包括那些发生在建筑材料、工作流程、设备、公用实施和暖通空调方面的技术发展。一次性使用、封闭、连续和模块化工艺设计正在改变空间分配和分级的范式。
目前，先进无菌工艺解决方案、设施设计和建设支持的合格供应商正在快速提供灵活且适应性强的设施。这些供应商为研究、开发和制造提供了符合要求的材料、空间分配、工作流程和设备设计。理解产品和工艺灵活性的高通量和直接制造方法是现在的要求，并且能够建立灵活的制造工艺和空间，以便在现有的产品活动或新开发的候选产品之间快速转换。
模块化和通用化预制设施设计已经成为许多项目的常规考虑。它们可以减少占地、上市时间、服务需求和运营费用。多产品、工艺设计和工艺链，可以更便宜地建造和操作，也可以提供更多的灵活性和高度的环境可持续性。另外，还有一种朝向分级空间嵌套的趋势。预制的通用化车间可以安装在非分级(灰色空间)环境中，并在内部添加封闭系统，可以在减少分级的情况下进行操作。
甚至传统的仓库设计和操作也在发生变化。自动存储和检索系统可以大大增加存储容量和拣选效率。新的仓库设计、软件和自动化检索设备可以提高生产力，恢复地板空间并通过绝对符合人体工程学的性能，提高拣选精度。
mRNA疫苗药物底物工厂
mRNA疫苗的开发和生产在许多方面与许多其它受监管的生物制品相同，例如，许多服务、供应和质量控制技术。但有些元素是截然不同的。就mRNA疫苗而言，在相对小规模的发酵罐/反应器中进行的产品生产与更大规模的生物制造是不同的。
从监管的角度来看，由于此类疫苗的新型组成，甚至很难知道从哪个部门或机构开始申请。例如，FDA有两个基本部门分别管理者生物化合物和药物化合物的注册，即CBER和CDER。区别需要具体的研究，因为它们不一定是从术语中得来的直觉。事实证明，目前的mRNA疫苗并不被认为是一种先进治疗药物(ATMP)，在美国，是在CBER的管理下申请BLA。
关于工厂，FDA的“Development and Licensure of Vaccines to Prevent COVID-19 Guidance for Industry”（预防COVID-19疫苗开发和许可行业指南）(FDA 2020- d -1137)为工厂本身提供了相当标准的指南，例如操作应充分设计，以防止污染；设施和设备的清洁和维护、除菌过滤和无菌作业等过程必须经过验证；HVAC系统必须提供足够的控制；生产设备应该经过质量确认。
它明确建议与CBER的合规和生物制品质量办公室沟通，讨论检查事项，检查通常在BLA文件接受后进行(21 CFR 601.20)。但是，报告指出，在COVID-19突发公共卫生事件期间，FDA正在使用额外的工具来确定是否需要进行现场检查。
mRNA疫苗药物底物生产设施将按照上述生产活动大纲支持三项基本工作，包括:1)转染细菌的发酵，如大肠杆菌，以生产质粒DNA，然后纯化质粒DNA，2)以该质粒生产和纯化mRNA药物底物，3) 聚合物或脂质纳米颗粒与mRNA药物产品的“偶联”生产。生产工厂将直接支持所有这些工作，当然，也需要诸如缓冲液/培养基制备、称重/配液等标准区域。
通常，一个单独的生产车间 (或适当的空间) 将用于1)缓冲液和培养基制备，2)mRNA生产，3) 纳米颗粒制剂，4) mRNA /纳米颗粒组装，5)最终药物产品原液的制剂/除菌/包装。一些开发商将在同一区域内操作步骤3和步骤4。根据规模，缓冲液可以从缓冲液制备区以两种方式进行分发：它可以通过管道(固定的或灵活的一次性使用管路)直接从缓冲液制备间输送到生产车间，或者通过料液袋转移到需要的设备，并通过柔性连接进行转移。公用设施版块是常见的，其中包括仪表和工艺空气、氧气和氮，以及溶剂水废料池站。工厂必须认识到溶剂使用要求以及任何需要注意ATEX或XP标准的NEC1或2级房间或区域的工艺步骤。
对于疫苗产品开发商、材料供应商和工厂设计者来说，这都是激动人心的时刻。CureVac此前宣布与Elon Musk合作制造“移动分子打印机”，表明了mRNA疫苗生产工艺和车间设计的各种可能性。虽然这些“mRNA微型工厂”的尺寸和要求的细节尚未公布，但我们可以看到，它们被描述为高度自动化的技术，并被设计成可以运往偏远地区。这可能表明，与现有的mRNA疫苗工厂相比，其将提供独特的服务支助，并减少占地/人员需求。
原文：W.G.Whitford, mRNA Vaccine Production and Facility Design. Cell Culture Dish, 2021.
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