昨天、今天和明天：基因治疗生产和工艺开发不断演变的格局
本文节选自来自AGTC的研究人员发表的文章《Yesterday, today and tomorrow: the evolving landscape of gene therapy manufacturing and process development》，详细内容，请参考原文。
第一个获批的基因治疗程序是在30多年前进行的，该程序要求将经过体外修饰的患者细胞重新回输至患者。在过去的30年里，该领域取得了巨大的进展，2017年FDA批准了LUXTURNA® (voretigene neparvovecl -rzyl)，这是一个重要的里程碑，这也是第一个设计用于体内给药的基因疗法 (体内基因疗法Glybera®于2012年在欧洲获得批准，但从未获得FDA批准，且在2017年因商业化挑战，推出了市场)。如今，多种体内基因疗法已进入后期试验阶段，各种各样针对罕见的遗传疾病和更大范围适应症的早期项目也在开发当中。在这个过程中，基因治疗载体的生产成为了一个主要障碍，阻碍了从概念验证研究到后期临床开发以及商业化应用的进程。
随着更多的基因疗法获得批准，生产仍然是获得监管批准和商业化成功的关键问题。要想充分实现基因治疗的临床和商业价值，我们必须了解过去的挑战是如何影响和塑造基因治疗生产的现状的。为了推动基因治疗生产过程的持续改进，我们不仅需要利用基因治疗领域的经验教训，而且还要从其它类型治疗药物的发展中吸取教训。
相比贴壁细胞生产工艺，悬浮培养的优势
与许多创新的治疗方法一致，基因治疗技术起源于学术实验室，其中，载体生产是获得临床前研究所需物料的重要组成部分。因此，最初的生产工艺在很大程度上只关注时间和成本效益，较少强调产量、生产力或可放大性。为支持临床前安全性和有效性的研究，贴壁细胞生产工艺 (细胞在与培养容器表面接触的情况下生长) 足以为体外和体内工作提供所需的物料。这些工艺允许基因治疗的新生领域证实其潜力，以解决各种疾病适应症未被满足的需求。
然而，随着学术实验室和生物制药行业认识到基因治疗的前景，并开始进行基因治疗产品开发活动，特别是对于大剂量或高患者群体适应症，为了支持临床试验并满足潜在的市场需求，需要更多的载体，这暴露了贴壁细胞生产方法的局限性。提高基于贴壁细胞生产的载体的产量只能通过规模扩展（scale-out）来实现 – 即使用越来越多的固定体积容器 (例如，组织培养板、滚瓶或细胞堆栈)，而不是通过使用体积越来越大的生产容器来进行规模放大（scale-up）。规模扩展增加了试剂、人员和设备成本，以及在开放式系统中接种、传代或收获细胞时发生污染的风险。
相比之下，基于悬浮培养的载体生产工艺提供了规模效益，这是其它生物疗法 (包括治疗性蛋白质和单克隆抗体) 生产长期以来所实现的。基于悬浮培养的方法还可以通过使用更大的生物反应器容器实现简单的规模放大，这些容器不需要显著增加试剂、人员或设施要求。此外，使用悬浮培养生物反应器可以设计成封闭或半封闭的系统，减少了操作人员错误和污染的可能性。最重要的是，其它生物制品中使用的工艺强化方法显示，悬浮培养生产工艺可以获得更高的产量。这种方法对于满足群体更大的适应症的需求至关重要，如年龄相关性黄斑变性，或需要全身注射以获得治疗效益的适应症，如杜氏肌萎缩症。高密度、固定床、贴壁细胞生长生物反应器提供了优于其它贴壁细胞生产工艺的优势，但仍然受到只能规模扩展的限制。现有最大的固定床生物反应器(500m2)理论上可容纳5 × 10^11 - 1 × 10^12活细胞总量。相比之下，使用已经成熟的商业化悬浮培养工艺，这个数值可以在25 - 50 L的搅拌罐生物反应器内实现，其密度可达到2 × 10^7 cells/mL，并在1000 L规模下执行。已经有研究报道建立了超过1× 10^8 cells/mL的系统，证实了悬浮工艺强化的潜力，可满足基因治疗的需要，且在其它形式的治疗药物生产中，已经开始使用2000-4000L的一次性使用生物反应器。对于依赖瞬时转染的基因治疗生产工艺来说，固定床贴壁生物反应器可能是最具成本效益的，但当使用稳定生产细胞系方法时，如疱疹辅助载体扩增方法、腺病毒辅助系统或杆状病毒感染昆虫细胞技术时，这种好处就失去了。
最后，从监管角度看，对于其它类型生物制品基于悬浮的生产方式已经有了明确的范例和指南，这也可为用于基因治疗载体的稳健、可放大方法的开发和实施提供有用的信息。
分析在基因治疗工艺发展中的关键重要性
2002年，美国食品和药物管理局(FDA)发布了21世纪药品现行良好生产规范(cGMP)，以实现药品生产和产品质量监管的现代化。该计划在药品生产和监管方面的五个主要目标是：
通过设计有效且高效的生产工艺，确保产品质量和性能;
根据对制剂和工艺因素如何影响产品性能的理解，制定产品和工艺规范;
实时质量保证;
根据最新的科学知识调整相关的监管政策和程序;
开发和实施基于风险的监管方法，认识到对制剂和生产工艺因素如何影响产品质量和性能的科学理解，以及过程控制策略的能力，以防止或减轻生产劣质产品的风险。
2004年，FDA发布了PAT行业指南 - 创新药物开发、生产和质量保证框架，该指南概述了如何将过程分析技术(PAT)纳入药物生产，以实现2002年cGMP倡议的目标。PAT的一个关键目标是从生产过程结束时的质量评估转向在整个生产过程中提供实时质量评估，并控制关键质量属性和关键工艺参数。后一种方法对于基因治疗的生产尤其重要，因为基因治疗载体非常复杂，不同的因素可以单独或共同地促进最终产品的安全性和有效性。
PAT应该有实时评估质量属性的目标。例如，对于AAV生产过程中空衣壳和完整衣壳的分离，可以实施在线PAT来监测和控制纯化步骤。
更广泛地说，基因治疗生产的分析需要解决多个问题，包括：
空载体与完整载体 (即含治疗性基因的病毒颗粒与不含治疗基因的病毒颗粒)的比例，这在给予患者的总病毒载量中起着至关重要的作用。由于病毒载量的增加可能导致不良事件，因此极可能提高完整载体数量比例对于提供治疗剂量、优化患者安全性至关重要;
最终物料的纯度。这在使用辅助病毒或其它需要从最终产品中去除的工艺材料的基因治疗生产过程中尤其重要;
最终物料的效力。基因治疗的疗效是多个载体特性的共同结果，包括有效转导靶细胞的能力，治疗性目的基因的表达水平以及所表达蛋白的稳定性。分析测试方法的开发、确认和验证，需能充分表征这些特性;
上游生产工艺中的过程中检测，如细胞培养代谢产物和细胞活性的评估，以及下游纯化中的过程中分析，如聚集程度和完整 - 空载体的比例，可以进一步细化工艺。
针对特定基因治疗载体的分析方法往往需要针对每种候选治疗方法的生产方法和独特特性进行定制。
此外，应该对其它生物制品分析方法的最新进展进行评估，并考虑将其纳入基因治疗生产过程。这些技术包括使用“智能”传感器、泵、阀门和电机，其可实时监测细胞培养条件并提供反馈，而不需要连续手动采集样品。质量源于设计（QbD）方法是基于实现预定终点和基于稳健科学的系统性方法，也应该被考虑。QbD方法包括使用物理传感器的实时监控和先进的过程监控和控制，利用这些传感器的数据来建模单元操作和预测工艺性能，并利用技术来确保在整个生产过程中保持目标指标。这些方法可能有助于减少批次间的变异性。
更早投资于后期生产方法的价值
生产工艺开发和分析工作需要资金、人员和资源的投资。因此，开发基因疗法的公司必须在其更大的产品组合和战略目标的背景下，考虑这些投资的数量和时机。虽然在开发的早期阶段对后期生产工艺进行投资有内在的风险，但生物制药行业最近的一些事件表明，没有在早期进行投资，实际上会造成更大的风险，特别是可能导致临床开发和商业化的延迟。随着越来越多的基因治疗项目进入后期试验阶段并接近商业化，越来越明显的是，生产方面的问题有可能推迟临床进展。2020年，FDA要求多家公司提供更多有关基因治疗生产的信息。在其中一个案例中，FDA要求进行一种新的效力分析方法，以证明商业生产工艺与用于临床试验物料生产的早期工艺之间的一致性。2017年，一个与效力分析有关的类似问题导致脊髓性肌萎缩症(SMA)基因治疗关键试验的启动被推迟。最近，一项针对B型血友病的关键试验计划被推迟了大约两年，以解决来自FDA的、与CMC相关的反馈，这部分与规模有关。
这些事件突显了在关键试验启动之前开发、实施和优化商业生产工艺的重要性，以最大限度地减少临床开发延误，而临床开发延误本身就可能代价高昂。这些事件还突显需要与FDA和其它监管机构进行频繁且富有成效的对话，以确保采取适当的措施来调整或修改基因治疗生产工艺，应对不断变化的监管要求。随着越来越多的基因治疗项目走向商业化，监管机构需要解决实际的而不是理论上的生产相关问题，这种情况可能也还会继续发生变化。
前途与危险：基因治疗生产的前景
不断增加的获批产品数量以及越来越多的临床安全性和有效性数据，证明了基因治疗在解决不同适应症中尚未满足的迫切医疗需求方面的潜力。无论是好是坏，基因治疗生产现在正受到更严格的监管审查，我们行业改善患者治疗的能力要求我们继续提高可放大性、生产力、纯度和效力，并适应不断变化的监管格局。虽然我们实现这些重要目标的能力在很大程度上取决于生产过程，但在载体开发方面的持续创新对于提高产量和降低成本也很重要。新型衣壳一直是业界关注的焦点，它们不仅在生产领域，在提高疗效和安全性方面都有很大的应用前景。
此外，迄今为止获批的基因疗法，治疗SMA的Zolgensma® (onasemnogene abeparvovecc -xioi)和治疗莱伯氏先天性黑蒙症的LUXTURNA® (voretigene neparvovec)，是目前美国最昂贵的两种药物。成本将在下一代基因治疗产品进入市场、并确保公平的可获得性方面发挥重要作用。在这方面，高生产率、高成本效益的生产将是这些疗法整体价格的关键组成部分。
只有像重视安全性和有效性一样重视生产，我们才能真正为许多健康和生存“掌握”在我们行业手中的患者提供基因治疗的好处。
原文：D.R.Knop, Yesterday,today and tomorrow: the evolving landscape of gene therapy manufacturing andprocess development, Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(3), 373–378.
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