慢病毒载体生物工艺和生物分析的当前现状及未来展望
本文节选自对Quell Therapeutics载体工艺主管Paul Carter的专访，详细内容，请参考原文。
问：大流行对病毒载体生物工艺实践的影响如何?您预计该行业将持续面临哪些相关挑战?
PC：COVID-19大流行确实推动了生物制造行业的发展，因为需要高度加快COVID-19疫苗的开发和生产工作。它们使用可用于病毒载体制造的、相同类型的技术和制造工厂。因此，如果此前已经存在与病毒载体产能相关的挑战的话，那么快速生产COVID-19疫苗的需求又加剧了这一挑战。
我认为，COVID-19大流行提高了生物工艺行业的知名度，因为它有能力帮助提供急需的疫苗，所以这也是一个好处。然而，总的来说，它突出了生物制造产能危机的多个具体方面，如灌装，因为灌装用小瓶的供应短缺。
一个不太明显的方面是检测能力的压力。COVID-19疫苗放行检测所需实验室与用于病毒载体批量放行检测的实验室相同。这增加了延迟的可能性，因为各自的CRO都被非常用力地推动着。例如，其中一些国家通过迅速建立新设施来应对这一挑战。我相信，在整个过程中，COVID-19疫苗放行检测是优先考虑的，这也是完全合理的。
由于COVID - 19疫苗和病毒载体制造的技术要求相同，生物制造行业中有多个“点”正在被拉伸。然而，我相信这个行业的反应非常好，越来越多的制造产能在很短的时间内就上线了。
问：事实上，近年来，解决病毒载体驱动的基因治疗的产能不足问题一直是基于病毒载体的基因治疗的一个主题。您能进一步谈谈该行业在这方面做得如何，以及您预计未来会出现哪些相关趋势/发展吗?
PC：供应商已经意识到需要更大规模的病毒载体制造能力，且并正在从静态的2D生物工艺过渡到了贴壁生物反应器。有一些很好的例子，采用了他们的工艺的公司，已经从细胞堆栈扩大到了贴壁生物反应器，并成功地提高了他们的单位体积产量。
悬浮培养也越来越受到重视，它可以大大简化规模放大过程，提供放大到数百升甚至数千升的选择。不过，它也有自己的一些问题。例如，进行大规模转染较为困难，即使使用一些新的聚乙烯亚胺(PEI)转染方案和试剂，当达到数百升时也很困难，而这很可能仅仅是因为在这个规模下的混合动力学所致。
有大量的工作正在发展生产和稳定细胞系，这将减少或消除对质粒DNA的需要。减少生产大量质粒DNA的需要，可缩短供应链，极大地降低复杂性和成本。稳定细胞系工艺，使用小分子诱导剂，如多西环素或cumate，来启动载体表达，比瞬时转染工艺容易得多，因为后者需要制造大体积的转染混合物，这是极具挑战性的操作，采用新技术还可避免工艺可变性的来源。
目前行业还在改进培养基和补液策略，以及实施灌流系统。这些都是获得更高细胞密度，并潜性地提高细胞培养生产力的方法。总而言之，有多种方法正在被研究，都试图解决产能不足的问题。
问：在解决传统上慢病毒载体产品成本高的问题上，您能更深入地介绍下吗?在这方面可能会取得怎样的进一步改善?
PC：主要是提高批次大小，我们已经讨论过，目的是降低单位载体的成本。随着该领域的规模从几十升扩大到数百升，可以显著节省成本。此外，从静态的2D培养方式向3D的生物反应器过渡，能够对上游工艺进行更多的控制，且有可能提高可重复性。
更好的工艺控制有利于获得更高的细胞密度，继而获得更高的载体产量。对生产系统更好控制也可能促使感染性的提高，从而对所生产的病毒载体质量产生积极影响。
转移到悬浮培养，甚至灌流培养，可以显著提高细胞密度和生产力，特别是当细胞生产载体的时间可以延长时。
通过提高单位体积载体产量来提高上游生产力，是降低载体成本的一种方法。减少下游工艺过程中的损失是另一个选择。在这种情况下，建立对各个下游工艺步骤及其对病毒载体质量和产量的影响的理解至关重要，其可提供对单元操作的见解，从而实现针对性的工艺发展工作，而后者会显著影响产品成本。
总而言之，行业正在采取多种措施解决病毒载体产品的高成本问题，并在这方面取得了重大进展。
问：近年来，您在下游载体生物工艺技术创新和发展方面看到了哪些积极进展?
PC：在载体的下游工艺中，人们开始更细致地研究层析填料，特别是在没有新的载体专用填料被开发出来的情况下，目前的主要工作是在研究如何更好地利用市面上已有的多种离子交换填料。我们对它们如何与病毒载体相互作用有了更深入的了解，这有助于提高工艺效率。
还有一些填料经过了专门的设计，以通过一种非常温和的方式来处理病毒载体。特别是如果您正在寻求使用第二个层析步骤，用于中间体纯化，以减少宿主细胞蛋白和DNA污染物。这些步骤可以在不影响病毒载体感染性的情况下，很好地去除关键污染物。
此外，用于载体工艺的超滤(UF)设备制造商也开始认识到载体工艺行业有特定的需求。因此，他们正在寻求具有更高截留分子量的产品组合，并将他们的筛选工作集中在更适合病毒载体工艺的选项上来。例如，一些过滤器制造商已经意识到对病毒载体进行除菌过滤是可能的，所以现在正在研究优化他们的一些膜技术。同样的情况也发生在超滤设备上：制造出易于规模放大和缩小的单元，以使工艺开发变得更加容易。
问：那生物分析方面呢?您最近有看到什么重要的进展吗?
PC：利用微流技术进行衣壳蛋白的自动化测量正开始得到更广泛的应用 - 它比ELISA检测要快得多，而且劳动强度要小得多。这也大大减少了差异性，这是处理病毒载体时的关键。
滴度和载体拷贝数的测定向数字液滴 (dd)PCR或数字(d)PCR的过渡使这些实验更容易、更直接地实现自动化，因此可以获得比采用荧光激活细胞分选(FACS)分析法高得多的通量。
我们也在更详细地研究病毒载体，特别是它们的聚集状态。正如我之前提到的，病毒载体的除菌过滤存在一些问题。然而，如果能够很好地理解病毒载体的聚集状态，例如通过使用DLS(动态光散射) 等技术，就可以很好地理解各种工艺步骤对载体的影响。
最后，拥有快速的分析，而不是等待结果，将对生产产生巨大的影响，并有助于降低工艺开发周期的时间。
问：在未来的生物工艺和生物分析创新方面，您的期望是什么?
PC：有一种用于VSV-G假型病毒载体的Protein A样的纯化产品将是一个真正的行业游戏规则改变者。这样的亲和配基，可允许实现快速捕获和释放，允许多循环层析，并允许我们在更温和的条件下纯化慢病毒载体。开发VSV-G亲和配基当然面临一些挑战。然而，我知道有一些公司对如何实现这一目标非常感兴趣。
此外，有更好的方法来检测慢病毒载体的感染性将是非常有帮助的。目前，我们通过感染性滴度和p24浓度来得出感染性。更快、更简单的分析方法将对整个流程产生很大的不同。
最后，如果慢病毒载体领域有类似快速色谱分析空/完整AAV的方法，那就太好了。我认为慢病毒生物学将使这点非常具有挑战性，但我希望看到大家能致力于此。
问：慢病毒载体的最佳分离纯化系统是什么样的?
PC：这个问题需要回到最初的原则，并问自己，“在这个工艺的不同步骤中我们想要做什么?”如果我们假设我们有细胞或细胞碎片需要去除，那么首先要考虑的是某种收获过滤，它将澄清物质，允许我们在工艺的早期进行层析步骤。
其次，当我们需要处理数百升的体积时，去除“水”的最好方法是什么?这里的主要目的是降低体积，因此结合/洗脱层析步骤可能是理想的选择。我已经提到了亲和步骤的潜在积极影响，如果实现，它将使物料快速浓缩，同时仍然保持感染性。
该工艺的下一步将是温和的中间体纯化，以处理宿主细胞蛋白质和DNA污染物。一旦大部分纯化完成，我们需要评估是否要进一步浓缩以及如何进行载体产品的制剂。我会选择超滤(UF)步骤，因为这些步骤可以用来浓缩物质，然后是洗滤(DF)，以进行慢病毒载体的制剂。
此外，我赞成不试图运行一个完全封闭的工艺，以确保无菌，而是更喜欢在工艺的最后使用除菌过滤。它使工作更容易，因为它可确保产品是无菌的，因为已通过了除菌级过滤器。这是一个非常重要的步骤，特别是当工艺规模增加时。
接下来，需要考虑容器的选择，是使用袋子还是小瓶(这取决于载体是如何添加到细胞工艺中的)。
最后，考虑到载体的数量和维持感染性所需的冷冻速率，需要对低温保存方案进行优化。
当然还有其它方面，如工艺过程中的温度控制，这是非常重要的。然而，所提到的这些以及如何结合它们，以获得最佳性能，是在整个工艺过程中控制病毒载体感染性的关键。
原文：P. Carter, Current and future perspectives on lentiviral vector bioprocess and bioanalytical tools.Cell & Gene Therapy Insights 2021; 7(3), 367–372.
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