舒桐科技 | CAR-T疗法临床前研发解决方案

引言

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。该疗法是一种出现了很多年但近几年才被改良使用到临床中的新型细胞疗法。其特异性高、杀伤力强的特点引领了继放化疗、靶向治疗后癌症治疗的第三次革命。近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外，经改进后，也被用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和心脏病等疾病，具有更广阔的应用空间。

CAR-T疗法的关键之处在于识别靶细胞的CAR结构构建。CAR分子是影响CAR-T细胞治疗有效性的关键因素之一，因此，需要构建合理的CAR结构。CAR结构需要具备高特异性，能避免脱靶毒性导致严重的毒副作用；其次，具备高效的共刺激结构域，提高T细胞增殖活性、肿瘤细胞杀伤力，延长T细胞存活时间。除此之外，精准整合、规避脱靶、导入效率高的CAR序列递送方案同样至关重要。

珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，搭建了一站式基因编辑平台，为CAR-T疗法临床前研发阶段提供完善的解决方案，帮助企业揭示细胞疗法的全部潜力。

什么是CAR-T细胞疗法？

CAR-T细胞疗法是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。与传统药物不同，CAR-T疗法是一种“活的”、定制的细胞治疗方法，利用患者自身的免疫T细胞来攻击癌细胞。

CAR-T疗法的整个流程大致可以分为五步：
• 从患者（或同种异体的供体）采集外周血并分离T细胞；
• 利用基因工程技术转导T细胞，给T细胞装上一个“GPS导航系统”，即CAR，这样T细胞就“变身”为CAR-T细胞；
• 将CAR-T细胞进行体外培养和扩增，使其达到符合治疗要求的细胞数量；
• 对CAR-T细胞进行质量检测；
• 把制备好的高质量CAR-T细胞回输到患者体内，靶向杀死癌细胞，同时避免对正常组织的损伤。

CAR-T疗法研发路线

CAR-T 研发重点：

（1）靶点筛选：CAR-T疗法是靶点依赖型的治疗手段，需要去选择一个高效、特异性极强的肿瘤标志物作为靶点；

（2）CAR-T结构构建：准确高效的将CAR序列整合至T细胞、避免脱靶；

（3）CAR-T功能验证：评估CAR-T细胞制备效果、评价CAR-T细胞对肿瘤杀伤活性、安全性。

舒桐科技CAR-T疗法临床前研发解决方案

1、靶点/药物筛选

通过比较来自肿瘤和非恶性组织样本的 DNA 测序数据，人们已经确定了许多与肿瘤相关的体细胞突变。其中一些突变可能产生肿瘤特异性的新抗原，如果这些新抗原呈现在细胞表面，就可能作为 CAR-T 或 TCR-T 的新靶点。

舒桐科技方案

CRISPR sgRNA文库助力筛选靶基因

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通过全基因组文库化 CRISPR-Cas9敲除筛选，随后通过测序检测单个sgRNA的频率富集情况，可以大规模、高通量的研究和评估不同条件下单个基因的影响，从而更高效地确定细胞的功能依赖性。这种功能基因组学分析手段可以帮助我们确定涉及 T 细胞激活、持久性、细胞毒性和功能障碍的关键基因，以及影响治疗耐药性的肿瘤细胞的遗传改变，提供可能被利用来提高 CAR-T 治疗疗效的调控因子。

舒桐优势：现货人全基因组敲除文库，高覆盖度、高均一性；定制化方案，提供基因list，设计sgRNA并构建sgRNA文库。

现货文库

文库覆盖度数据

文库均一性数据

2、 CAR-T细胞构建

在将CAR序列整合至T细胞的过程中，包括病毒和非病毒递送体系。病毒递送体系是通过病毒来把CAR基因整合到T细胞，但其中存在CAR序列会随机插入细胞基因组任意位置的风险。可能干扰整个基因组功能、影响随机插入位点附近的功能基因表达。非病毒的是用CRISPR将CAR定点整合到内源性TRAC等基因，达到同时敲除内源性TCR和敲入CAR的目的。目前，“CAR-T之父”Carl H. June教授在内的一些团队已经在临床试验中获得了部分基于CRISPR技术制备的CAR-T细胞安全有效的证据。目前，CRISPR技术在下一代CAR-T细胞制备工艺中展现出巨大潜能。

舒桐科技方案一

安全高效的病毒递送体系及载体整合位点检测

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病毒包装是进行CAR-T细胞制备的一个关键环节，病毒滴度是决定CAR转染阳性率的关键因素。舒桐科技可以提供病毒包装的关键原材料如SuperTransfect 转染试剂，以及质粒构建。另外，我们也可提供病毒载体整合位点检测服务，充分保障CAR-T药物的安全性。

舒桐优势：

（1）病毒包装：多载体选择，包括慢病毒、AAV、非整合型慢病毒，病毒包装高质量、高纯度、高效准时；

（2）质粒构建：CRISPR/Cas克隆质粒、转座子质粒等选择，快速交付，质控严格；

（3）SuperTransfect 转染试剂：转染效率高，在HEK293细胞中的转染效率高达95%，高于市面上常用转染试剂；

（4）病毒载体整合位点检测：不依赖于限制性内切酶，灵敏度和特异性高，可用于复杂或微量样本中病毒载体整合位点的检测；服务周期短，可提供原始数据及可视化结题报告。

舒桐科技方案二

提供多种新型CRISPR基因编辑工具及全面的脱靶检测服务

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CRISPR技术编辑T细胞流程

Tips：基于CRISPR技术的CAR序列整合方案的优势

更安全！可将CAR序列插入到特定的位点，例如T细胞受体位点（TRAC）、任何基因组上的安全港位点

更高效！可敲除T细胞天然受体和PD-1免疫检查点，增强T细胞活性和持久性

更简单！实验操作简单，更易于后续GMP工艺开发与成本优化

舒桐科技优势：多种具有自主知识产权的新型CRISPR基因编辑工具，脱靶检测的领航者

（1）sgRNA筛选：Pooled AID-seq sgRNA筛选，高通量sgRNA筛选策略，可一次性检测上百条sgRNA的在靶/脱靶情况，并基于大量的数据建立新型CRISPR蛋白的脱靶预测模型；

（2）新型CRISPR蛋白：FrCas9切割效率强、脱靶效应低、特异性好、PAM限制少；提供高纯度高浓度的AsCpf1、LbCpf1、SpCas9核酸酶；

（3）脱靶检测：国内首家提供脱靶检测服务的公司，可提供全基因组脱靶检测、GUIDE-seq体内脱靶检测、AID-seq体内脱靶检测、染色体重排检测等多种服务。

3、CAR-T功能验证

构建完成的CAR-T细胞即可进入功能验证环节，例如通过CAR表达量检测确认效应CAR-T细胞制备效果、通过肿瘤细胞杀伤实验检测CAR-T细胞体外药效、通过模式动物评估CAR-T细胞体内安全性与药效等等，这些都将为CAR-T细胞的成药性提供重要依据。

舒桐科技方案

构建细胞系验证CAR表达/CAR-T对肿瘤细胞杀伤活性

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舒桐优势：规模庞大、品种齐全的科研细胞库，成熟的细胞系构建技术平台

（1）细胞库：舒桐搭建了规模庞大、品种齐全的科研细胞库，包括野生型细胞及稳转细胞库（GFP, RFP, Cas9, luc等）；

（2）细胞系构建平台：建立了一套成熟稳定的基因干扰表达的实验体系，可针对多种不同细胞（包括难转染细胞）为您提供定制化基因过表达稳转细胞株的构建服务。

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