scRNA-seq揭示非病变性狼疮皮肤有助于骨髓细胞的炎症进展并引发皮肤炎症
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文章信息
文章题目： Nonlesional lupus skin contributes to inflammatory education of myeloid cells and primes for cutaneous inflammation
期刊： Sci Transl Med
影响因子: 1区17.956
发表时间: 2022年4月27日
DOI: https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abn2263
文献概述
问题：皮肤红斑狼疮 （CLE） 是一种毁容性炎症性皮肤病，影响 70% 的系统性红斑狼疮 （SLE） 患者。虽然约50%的患者对SLE靶向治疗有反应，即使他们的全身性疾病得到控制，许多患者仍患有难治性皮肤病变。缺乏关于CLE的炎症成分和诱发疾病的驱动因素的知识，推迟了有效的治疗发展。
方法：通过整合的单细胞RNA测序和空间RNA测序分析了狼疮患者中正常出现的皮肤，病变皮肤和循环免疫细胞。全面定义细胞组成并表征导致该疾病的炎症变化的主要介质。同时检查了相同患者的外周血，以研究在病变和非病变皮肤中表现突出的单核细胞衍生的CD16+树突状细胞（DC）的皮肤进展。
结论：病变和非病变皮肤中的基质细胞和炎性细胞之间的IFN丰富和离散的促炎细胞通讯网络，支持皮肤在启动SLE患者的炎症反应中的关键作用。狼疮患者正常出现的皮肤代表了I型干扰素丰富的病灶环境。干扰素使富含CD16+树突状细胞在皮肤中获得促炎表型。
实验结果
CLE患者病变和非病变皮肤的单细胞RNA测序可识别不同的皮肤和免疫细胞群
对7名活动性CLE患者的病变和防晒非病变皮肤进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。与来自不同解剖部位的14个健康对照组的皮肤平行分析。最终数据集包括46540个细胞聚类为26个细胞簇，注释为10种主要细胞类型，每种细胞类型都包含来自病变，非病变和健康对照皮肤活检的细胞。相对于健康对照，病变和非病变皮肤中角质细胞和髓系细胞的比例增加，而成纤维细胞和平滑肌细胞比例降低。
CLE 患者病变和非病变皮肤的 KCs 表现出病理性 I 型 IFN 特征
大多数细胞是角质细胞，进一步对角质细胞聚类发现14个亚群，包括（5，6，8和13）由狼疮患者的KCs组成（但是这里看起来11亚群的KCs比例也挺高）。注释为五种KC状态：basal, spinous, supraspinous, follicular, and cycling。
scRNA-seq的深度相对较浅，无法直接检查与CLE有关的许多细胞因子的转录本水平，特别是IFN。为了研究细胞因子反应是否驱动了CLE中疾病的KC亚聚集，使用小组先前开发的细胞因子反应特征，这些特征包含通过一组细胞因子[IFN-α，IFN-γ，肿瘤坏死因子（TNF），白细胞介素-17A（IL-17A），IL-1B，IL-36，IL-4，IL-13或IL-17A和TNF组合]刺激原代人KCs时诱导的基因。狼疮富集的基础（亚群8）和棘（亚群5和6）亚群几乎完全由具有高IFN-α模块评分的KCs组成。而在这些簇中得分最高的细胞来自于非病灶活检，表明即使是CLE患者的正常皮肤也处于“病灶前”状态，由I型IFN信号传导升高引发。与健康对照组相比，滤泡KC亚簇（10和11）在非病变和病变样本中显示IFN-α细胞因子模块评分升高，表明滤泡上皮也代表了CLE中异常的，富含IFN。
为了更广泛地了解CLE患者病变KCs的转录组差异，进行 the lesional CLE versus healthy basal KCs 之间的差异表达分析
病变细胞中顶部上调基因中的I型IFN下游基因（例如MX1，IFITM1，IFITM3，IFI6，ISG15和IFI27）。然后，我们使用IPA分析来确定预测为病变样品中诱导的基因的上游调节因子的细胞因子，主要将IFN鉴定为富含CLE的转录本的上游调节因子。
这里 IPA 的输入数据很简单，下面是数据示例
scRNA-seq鉴定出富含CLE的成纤维细胞亚型，表现出强烈的IFN反应特征
接下来把成纤维细胞（FBs）细分亚群。只有一个亚群（4）由狼疮患者的FB主导。IFN FB最独特的区别在于IFN-α和IFN-γ细胞因子特征，与KCs一样，IFN细胞因子模块评分在非病变FB中最高。高FB IFN模块评分主要限于IFN FBs的单个亚群，表明CLE患者皮肤中只有特定的FB子集表现出强大的IFN诱导的基因表达变化。这与 KCs 形成了有趣的对比，其中非病变和病变性 KCs 在大多数亚集群中显示出较高的 IFN 模块评分。basal KCs (N versus H) and IFN FBs (N) versus SFRP2 FBs (H)
CLE 患者 T 细胞浸润病变性和非病变性皮肤，在包括调节性 T 细胞在内的多个亚群中表现出 IFN 教育
T细胞细分亚群，一个亚簇的细胞通过ISG的表达来区分，因此被指定为IFN T细胞。IFN T细胞主要来自狼疮样本。非病灶性与健康对照T的基因表达发现许多 ISG，表明慢性 IFN 刺激。IFN介导的Treg功能障碍的致病作用。
T细胞的一个亚群与Treg紧密联系但没有表达FOXP3。相反，该亚群表达CXCL13，CXCL13是一种吸引B细胞的趋化因子和SLE生物标志物，注释为Tph/Tfh。总之，T细胞失衡以及IFN T细胞和其他IFN影响的T细胞亚群（包括Treg）存在非病灶性样本中，表明在 CLE 患者正常皮肤的病灶前环境中存在异常的 T 细胞浸润。
在 CLE 患者的病变和非病变皮肤中检测到髓系细胞亚群的主要变化
髓系细胞细分亚群：
classical type 1 DC (cDC1; CLEC9A and IRF8), cDC2 subset A (cDC2A; LAMP3 and CD1B), cDC2B (CLEC10A and IL1B), plasmacytoid DC (pDC; GZMB and JCHAIN), CD16+ DC (FCGR3A and HES1), LC (CD207 and CD1A), lipid-associated macrophage (LAM; APOE and APOC1), perivascular macrophage (PVM; CD16+3 and SELENOP), pDC-like cell (PPP1R14A and TRPM4)。
与上述细胞类型相比，髓系亚群在健康对照，非病变和病变样本中表现出更大差异。
在健康的对照皮肤中，cDC2Bs占髓系的近一半（47%）;这与非病变性狼疮皮肤有很大不同，后者的pDCs占主导地位（41%）。CD16+ DC是一种促炎性骨髓DC亚群，与狼疮免疫发病有关，并且在狼疮患者的病变皮肤中增加。
配体-受体分析显示富集狼疮的预测细胞间相互作用主要涉及CD16+ DC+
CellPhoneDB
TC, T cell; ML, myeloid cell; MLNC, melanocyte; EC, endothelial cell; ECG; eccrine gland cell; SMC, smooth muscle cell.
在健康的对照皮肤中只有大多数代表KC-KC串扰。相比之下，非病变皮肤中FBs代表了非病变富集对中主要的配体表达细胞类型，但髓系细胞和内皮细胞（EC）也具有高度的相互作用。在病变皮肤中，髓系和EC在细胞 - 细胞相互作用者中最为突出。
髓系细胞在非病变和病变性皮肤中起着突出的作用。将KCs，FBs，T细胞和髓细胞分成各自的子集，关于基质细胞，KC亚群表达的配体主要向EC上的受体发出信号，这表明KCs可能影响免疫细胞组织浸润的机制。IFN FB是所有细胞亚群中最活跃的。然而，CD16+ DC和其他细胞亚群联系最多。
空间测序和scRNA-seq分析的整合提供了狼疮皮肤内细胞 - 细胞相互作用的结构背景
L-R分析完全来自差异基因富集，因此缺乏关键的空间背景来证实推定的相互作用。选择包含多个毛囊段的部分进行空间转录组深入分析。检测到632个空间定义的斑点。
在直径为55μm时，每个斑点可能占混合类型的多个细胞。空间热图证实了这一点，该热图显示了与主要细胞类型相对应的代表性标记基因的重叠表达。因此没有为每个斑点分配单个细胞类型，而是为每个斑点生成了一个饼图，显示了每种主要细胞类型的转录组学特征的表示。大多数具有高免疫细胞特征的斑点定位于表皮下和卵泡周围区域，分别对应于盘状狼疮的特征性界面皮炎和附件周围浸润。表皮下斑点显示出特别突出的骨髓特征，T细胞特征相对较弱，表明髓系对界面的强烈定位，可能是由KCs或FB在病灶前CLE环境中启动的信号传导的直接影响。
强烈表达LC基因特征的斑点仅限于表皮和滤泡上皮。真皮周的许多斑点在pDC中得分很高。CD16+ DC得分较高的斑点在浅表真皮中聚类最密集，再次表明这些细胞可以在由滤泡间表皮的基底KCs产生的富含IFN的环境中进行调节。
将CD16+ DC定义为CD14+CD11c+CD16+细胞。这确定了CD16+ DC主要集中在真皮表皮连接处正下方的浅表真皮中。在CD16+ DC的4μm距离内检测到不同的免疫细胞类型，单核细胞和巨噬细胞比淋巴细胞更常见。在分析中包含的基质细胞类型中，上皮细胞（此处为KCs）比EC更常出现在CD16+ DC附近，支持CD16+ DC和基底KCs之间的相互作用。
对成对循环和皮肤浸润的髓系细胞的伪时间分析表明，CD16+ DC起源于在狼疮皮肤中受IFN影响的非经典单核细胞
到目前为止，我们的数据支持CD16+ DC与皮肤中基质细胞的密切连接，因此我们接下来想要了解浸润狼疮患者皮肤的CD16+ DC的起源和表型。
通过scRNA-seq检查了来自上述狼疮的相同七名患者和四名健康对照组的外周血单核细胞（PBMC）。根据聚类结果选择髓系细胞进行进一步分析。然后将来自PBMC和皮肤的髓系细胞重新聚集在一起，以评估外周血和皮肤浸润亚群之间的联系。HP, healthy PBMCs; LP, lupus PBMCs.
来源于PBMC的髓系细胞和皮肤的明显分开。使用Monocle对ncMos和CD16+ DC进行的伪时间分析，外周血的ncMos渗透到皮肤中，产生CD16+ DC，从比例图可以看出，狼疮患者中CD16+ DC比例更高。在狼疮患者中观察到的ncMos和循环CD16+ DC比例的降低。
沿拟时序进行了差异表达分析。这确定了从ncMo到CD16+ DC过渡的五种基因表达模式。前80个重要标记基因显示这种转变主要以编码趋化因子的众多基因的后期上调为标志，KC衍生的I型IFN可以促进DC激活，使它们能够刺激皮肤中的免疫反应。
总结
证明了IFN对皮肤基质细胞和免疫细胞的普遍影响，这些影响在非病灶性样本中很明显，表明CLE患者的正常皮肤处于免疫启动的病灶前状态。 CD16+ DC与狼疮发病机制越来越相关，表明外周血中的ncMos会发展为CD16+ DC，激发组织炎症。
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