scRNA-seq揭示胰腺导管腺癌恶性进展过程中肿瘤微环境的动态变化

文章信息

文章题目：Single-cell RNA-seq reveals dynamic change in tumor microenvironment during pancreatic ductal adenocarcinoma malignant progression
日期：2021-04
期刊：eBioMedicine
DOI：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2021.103315

摘要

胰腺导管腺癌（PDAC）在所有胃肠道肿瘤中死亡率最高。根据年度癌症统计报告，最近 PDAC 的预后仅略有改善，5 年生存率为 8-9%。主要归因于PDAC缺乏早期诊断的可靠标志物、手术切除率低和放化疗耐药，只有15-20%的胰腺癌患者符合根治性切除术的条件，而根治性切除术是唯一可能的治愈性疗法。PDAC复杂的瘤内异质性和特殊的肿瘤微环境为制定有效的治疗策略带来了巨大挑战。

文章旨在利用单细胞RNA测序描绘 PDAC 恶性进展过程中肿瘤微环境成分的动态变化。系统地探索了从早期 PDAC 到晚期 PDAC 的肿瘤微环境的动态变化，并确定了一个新的癌症相关成纤维细胞 (CAFs) 亚群，命名为 csCAFs。应用加权基因共表达网络（WGCNA）验证其鉴定和生物学功能。

单细胞分析揭示了 PDAC 进展过程中的细胞成分变化

一共使用11个样本（4个PDAC I、4个PDAC II、3个PDAC III分别指I期、II期和III期PDAC患者），得到18555 个细胞。经过基因过滤、归一化、主成分分析后，聚类得到9个细胞群，包括导管细胞、巨噬细胞、B 细胞、内皮细胞、星状细胞、T 细胞、成纤维细胞、腺泡和内分泌细胞。

图h显示了3个不同临床时期的细胞比例变化，发现PDAC I中的大多数细胞是导管细胞（44.88%），仅有少量免疫细胞（17.06%）。导管细胞的数量随着肿瘤阶段的进展逐渐减少（44.88%-36.04%–18.95%）。免疫细胞（包括 T 细胞、B 细胞和巨噬细胞）的比例逐渐增加（17.06%-36.15%–43.14%）。说明：当肿瘤向恶性程度发展时，导管细胞将不再是肿瘤微环境的主要组成部分，免疫细胞在肿瘤中迁移和积累，反映了人体免疫系统对肿瘤病变的反应。

此外，由成纤维细胞和星状细胞组成的癌症相关成纤维细胞（CAFs）的数量逐渐减少（23.49% - 17.09% - 15.12%），但在 PDAC III 中星状细胞演变为主要群体。

PDAC进展期间的导管细胞异质性

为了揭示 PDAC 恶性进展过程中导管细胞的变化，作者对导管细胞进行了亚群分析。总共分析了 5800 个导管细胞，看到聚类分群得到明显不同的簇，表明在PDAC恶性进展过程中导管细胞的基因表达模式逐渐变化。

将来自 PDAC II 的导管细胞与来自 PDAC I 的导管细胞进行比较，并检测到 502 个上调基因和 259 个下调基因，并且在来自 PDAC III 的导管细胞中，144/502 个上调基因也显著上调。

GO富集分析表明，晚期PDAC（PDAC II和III）中上调的基因显著富集了几个与癌症相关的通路，如细胞粘附、细胞因子活性、趋化因子受体结合、趋化因子活性和R-SMAD结合，表明肿瘤细胞随着肿瘤进展对细胞因子和趋化因子的反应能力增加。相比之下，早期 PDAC（PDAC I）中上调的基因主要与正常的生物学功能有关，包括核糖体的结构成分、细胞粘附分子结合、钙粘蛋白结合和rRNA结合。

此外还对上皮标志物（EPCAM）、间充质标志物（FN1、MMP7和 VIM）和癌症干细胞（CSC）相关标志物（CD44、ALDH1A1和 NOTCH2）进行了基因表达分析。结果表明，早期PDAC中的导管细胞主要表现出上皮表达谱，而晚期PDAC中的导管细胞富含间充质标志物并且具有更高的CSC相关基因表达水平。

以上支持了上皮-间质转化和癌症干细胞特性随着肿瘤的进展逐渐积累，促进肿瘤侵袭和转移的观点。

检测到新的癌症相关成纤维细胞亚群（CAFs）

这里是为了证实在 PDAC 微环境中存在三个主要的 CAF 亚群——myCAFs（肌纤维母细胞 CAFs）、iCAFs（炎症性 CAFs）和 apCAFs（抗原呈递 CAFs）。

分析了来自 PDAC 的 2958 个具有不同临床阶段的间充质细胞，在 t-SNE 分析中形成了三个具有独特基因特征的不同亚群。常见的标志物，如ACTA2、TAGLN 和 FN1，在所有亚群中都有表达，证实了 PDAC 间充质细胞的身份。

此外，根据特定的基因表达谱鉴定出三个亚群：

• cCAFs（经典CAFs）：高表达COL1A1、LUM（细胞外基质相关成分）、MMP11（基质重塑分子）、FAP（基质成纤维细胞活化蛋白）、SFRP2 (Wnt 信号调节剂)
• csCAFs (complement-secreting CAFs)：表现出高度激活的补体系统转录，包括C3、C7、CFB、CFD、CFH、CFI，可能调节肿瘤内的免疫和炎症反应
• PSCs（胰腺星状细胞）：与 cCAF 和 csCAF 均不同，并表达星状细胞的标记基因，如RGS5、ADIRF、CRIP1、NDUFA4L2、NOTCH3 和PDGFA

又分析了这些亚群在不同临床阶段的 PDAC 中的比例，PDAC III中的微环境仅包含一种间充质细胞（PSCs），而不包含cCAFs和csCAFs。此外，PSCs 在 PDAC I/II/III 中占优势，并表达高水平的 αSMA。

使用Monocle 2 探索三个亚群的发育轨迹，发现了从 cCAFs 和 csCAFs 向 PSCs 的演变，还发现了细胞从早期 PDAC 到晚期 PDAC 的发展趋势，这与肿瘤进展方向一致。

PDAC中的肿瘤免疫浸润

肿瘤浸润性免疫细胞，包括 Tregs、衰竭 T 细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM) 和 Bregs，在肿瘤发生和转移中发挥重要作用。针对肿瘤微环境的癌症免疫疗法，如抗CTLA4和抗PD1疗法，明显改善了某些癌症患者的预后。然而，它们的治疗反应因癌症类型和患者而异。因此，必须筛选出候选标志物以预测对治疗的反应并开发新的免疫疗法。

分析了 PDAC 中的总共 1521 个 T 细胞，得到11个亚群，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、Th1/2、Treg、细胞毒性T细胞、效应T细胞、记忆T细胞和耗竭性T细胞。

研究相对比例时发现，PDAC II/III 比 PDAC I 呈现更多的细胞毒性 T 细胞、效应 T 细胞和记忆 T 细胞。同时，结果显示在晚期 PDAC 中也积累了更多的 Tregs 和耗竭性T细胞。

c 7 富含已知的调节和耗竭性T细胞标志物FOXP3 、TNFRSF18、CTLA4、TIGIT 、LAYN，因此被鉴定为 Treg/耗竭性T细胞。该亚群仅占总 T 细胞的一小部分，共有 481 个基因在该亚群中特异性表达，并在一些生物学过程中显著富集，包括 T 细胞活化的调节、细胞因子产生的负调节、炎症反应的负调节。

c 7 和 Treg 的特征基因与先前关于非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤和肝细胞癌的研究中报道的耗竭性T细胞标志物之间存在明显的重叠，在先前研究的 33 个常见标记中，这里鉴定了 22 个基因。

接下来，作者专注于 PDAC 诊断和预后的两个重要特征基因：IL2RA、DUSP4。

• TCGA数据库发现IL2RA与经典Treg标志物——CTLA4、FOXP3、TIGIT呈正相关（R分别为0.66、0.68、0.58）
• DUSP4在c7（Treg/耗竭性T细胞）中表现出高度特异性的表达模式，但在先前报道的常见标记中未发现；基于TCGA数据库的差异表达和生存分析，DUSP4高表达患者的预后明显低于DUSP4低表达患者

为了更好地了解 T 细胞的功能状态和关系，作者使用 Monocle 2 算法来确定它们的发育轨迹。发现树结构从具有CCR7、LEF1特征基因的naive  T 细胞开始，然后是效应 T 细胞() GZMK、GNLY )，再到 Treg / 耗竭性T细胞（ENTPD1、LAYN、FOXP3、CTLA4）。

肿瘤浸润免疫细胞的另一个重要亚群是巨噬细胞，其异质性在 PDAC 中仍不清楚。得到了4 个不同的巨噬细胞亚群。作者统计了不同临床分期的PDAC中这些亚群的数量，结果表明晚期PDAC（PDAC III）比早期PDAC（PDAC I和II）具有更多的M1，M2和TAM。

根据T细胞亚群分析，抗肿瘤成分（M1）增加，伴随着促肿瘤成分（M2和TAM）的浸润和积累，形成免疫抑制环境。此外，作者比较了M2（代表 PDAC III）和M1（代表 PDAC I 和 II），发现了 296 个上调基因和 461 个下调基因。

然后我们分析了 PDAC 中的 B细胞浸润，1657 个 B 细胞形成了 6 个亚群。发现 PDAC I 中没有 B 细胞浸润，而PDAC III 中的 B 细胞与 PDAC II 中的 B 细胞有显著差异。于是推测B细胞在PDAC恶性发展过程中逐渐渗透到肿瘤微环境中，并进化成具有独特基因表达谱和促肿瘤或抗肿瘤功能的不同亚群。

根据 CD1D、CD5和 TGFB1 等 Breg 标志物的表达，在肿瘤微环境中没有发现调节性 B 细胞 (Bregs)。

csCAF的加权基因共表达网络分析

WGCNA可以用来寻找一些具有高度相关的基因模块，每一个模块可以具有独特的生物学功能。

分别从 cCAFs、csCAFs 和 PSCs 中随机挑选出 30-50 个细胞来构建用于WGCNA分析的基因表达矩阵，得到三个不同颜色模块（turquoise、brown、blue） 和亚群 （cCAFs、csCAFs、PSCs ）之间的相关性。其中棕色模块可以很好地代表亚群csCAF。并且该模块中的基因主要富集于细胞外结构组织、血管发育调节以及凝血级联反应