Pre-gastrulation 人猪猴scRNA比较分析
分享是一种态度
文章信息
文章题目：Cross-species single-cell transcriptomic analysis reveals pre-gastrulation developmental differences among pigs, monkeys, and humans
期刊：Cell Discovery
日期：2021年2月
Paper ：https://www.nature.com/articles/s41421-020-00238-x
Data ：https://db.cngb.org/search/project/CNP0000872/
摘要
种间囊胚互补使得异种PSC 器官发生成为可能，不过目前人和宿主物种间的差异是这种嵌合的阻碍。本文构建了猪早期胚胎发育图谱，比较了人猴的epiblast发育，解释了种间差异：
多能性推进； 代谢转变； 多能性的转录和表观调控； 细胞表面蛋白； TE发育。
这些差异可能阻碍了供受体之间的融合。
引言
种间囊胚互补技术将一个物种的PSC注入另一物种器官发育不全的囊胚，在胚胎发育过程中，突变的宿主胚胎为供体PSC提供了一个空的器官发育位，从而产生富集了工体细胞的嵌合器官。猪是一个不错的受体。
种间囊胚互补嵌合的关键在于供体PSC在宿主物种中的嵌合能力。小鼠大鼠可以相互有效嵌合，可以产生对应供体的各种器官。目前发现，无论以何种多能性细胞或多少细胞进行注射，人猪囊胚互补很难在猪早期胚胎（E21-28）中进行有效嵌合，且嵌合水平远低于大小鼠，这表明人猪之间的嵌合障壁有点厚。
猪在前原肠胚发育过程中比其他哺乳动物更接近人：1.发育周期长；2.epiblast都自组织为扁平双胚盘而非杯状；3.早期谱系分离、多能性调控、PGC特化和XCI 具有共同调控机制。不同之处在于：1.人为血绒膜胎盘，猪为上皮绒膜胎盘；2.猪早期胚胎在E8-12期间急剧生长，E10由直径约2.6mm 的球状胚发育为管状，E12形成约100-150mm的细丝状。这可能就是阻碍因素。
对E5-6、E7-8、E10-11、E12-13时期的猪胚胎进行smart-seq2测序。用BGISEQ 测的，共301个样，可能比较便宜（每个样本差不多4-5G，大概30-40w）。同时进行了人、食蟹猴和猪的跨物种比较 。
作者直接下载的表达矩阵进行分析，人是汤富酬围着床期三组学的数据，GitHub上的代码不全，只能下载数据，相关文章解读见我的简书：
https://www.jianshu.com/p/3136264c378e
猴是16年日本学者做的人鼠猴比较的单细胞，SC3-seq，倒是可以处理，不过每个样本平均被拆成了6个SRA，整合也是麻烦事：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27556940
结果
Pig scRNA-seq预处理
四个时期收到510个细胞，筛除了基因数小于3000和离群较远的细胞（做个相关就解决了，这里没说，所以他指的离群不好定义），剩余301个细胞。猪大约在E13着床，故收到的都是着床前细胞。不过为了简化跨物种比较分析，将早期囊胚和晚期囊胚划入植入前胚胎阶段，将球形胚和丝状胚划入植入后阶段。
猪胚谱系特化
将四个时期的胚胎pool到一起，共计13227个基因（不知道基因筛选标准是什么）进行无监督聚类，细胞分为两个大群，这一情况与猴类似。根据stage和已报道的markers，将细胞分为ICM（E5-6），pre-EPI（E7-8），PostE-EPI（E10-11），PostL-EPI（E12-13），pre-HYPO，PostE-HYPO，PostL-HYPO，PreE-TE（E5-6），PreL-TE(E7-8)，PostE-TE，PostL-TE（这里主观性比较强了）。POU5F1在所有细胞中都高表达（HYPO会低一点），这一情况与食蟹猴和人类似，KLF4在ICM中高表达，后续发育为EPI后表达下调。除了ICM，PreE-TE也表达 KLF4，表明他们是壁TE而非极TE。NODAL在球状胚和丝状胚中表达，但是在囊胚中不表达，这一结果与之前研究一致；GATA6作为hypo marker在囊胚中高表达，同样在Post-HYPO中高表达。
为了确认谱系注释的准确性，将同类细胞pool到一起分析，管家基因PPIA作为对照用以定量其他基因在三谱系中的表达，每个谱系的注释挺对的。拟时分析表明，每个注释的谱系与采样时期可以对应。PreL-TEs出现分支，表明产生两个亚型，对应到小鼠上就是壁TE和极TE（极TE出现的太早了吧）检查了一些TE的markers，如ABCG2, AHANK, NSDHL，PRELID1，RAP11FIP4在type2高表达，极TE markers如FABP5, CAV1，GPX8在type3中高表达，表明type2和3分别代表壁TE和极TE。3D PCA 表明ICM/EPI、 HYPO、TE 大致可以分成两群，为E5/7-E10/12，表明在E7-10期间发生了较聚类的变化（推断为naive（E5-7）-formative (E8-9) - primed（E10-））。
综上，好像也没啥总结的。
EPI发育和多能性变化的跨物种比较
EPI为单层细胞上皮，可以产生体内所有组织。人猪嵌合体的成功与否取决于人PSC在猪EPI上的存活、增殖和适当分化。采用人猴胚胎单细胞数据进行比较转录组分析。为了最小化物种间时期不对应的偏差，先进行了pearson聚类。人E10 EPI与猪猴 PostL-EPI 相关性系数最高，人E8EPI 与猪猴PostE-EPI更相似，人 E6 EPI与猪猴ICM和Pre-EPI最相似。3D PCA 发现猴子和猪 EPI 分为两个主要cluster：ICM/Pre-EPI 和 PostE-EPI/PostL-EPI，但人EPI 并非如此，作者归因于人胚是in vitro的。
比较了猪（ICM/Pre-EPI 到 PostE-EPI）、猴子（Pre-EPI 到 PostE-EPI）和人类（E6 到 E8）的早期 EPI 发育（为什么不加猴ICM？）。在猪和人/猴中分别有 1067 个和 1174 个基因上调，而 674 个和 1147 个基因下调。GO/KEGG 表明，猪中上调的基因在“调节干细胞多能性的信号通路”、“嘧啶代谢过程”和“微管”等术语中得到了富集。人类/猴子中上调的基因在“PI3K-Akt 信号通路”和神经元发育中富集（这好像是单细胞的技术误差）， 在猪中下调的基因主要参与碳水化合物代谢过程和LIF介导的信号转导，而在人/猴中下调的基因在与免疫细胞增殖相关的几个方面富集。
接下来比较了晚期EPI的发育。猪特异性上调的基因参与酶联受体蛋白信号通路和细胞形态发生，而人/猴的基因则与细胞外结构组织和细胞连接组装有关，猪中下调的基因主要参与IL8的产生和分泌以及繁殖过程，而人/猴中的基因富集到低氧通路。虽然 PI3K-Akt 通路在人类/猴子早期 EPI 发育中富含上调基因，但它在猪晚期 EPI 发育期间上调的基因中过度表达。PI3K-Akt在人鼠早期EPI中富集，在猪中则晚期EPI富集（可能是猪EPI发育滞后），且该通路靶向基因ITGA5在人猴中显著上调，在猪中下调，展现出不同的表达模式：
EPI发育伴随多能性的变化，在物种间可能不同。将人猪猴早晚期囊胚数据pool，（猪 ICM 和 Pre-EPI；猴子 ICM 和 Pre-EPI；人 E6 EPI），将之统称为Pre-EPI。将除人E8外的其他人猴猪细胞成为Post-EPI（为什么不加人E8？）。整体而言，naïve基因在仨物种中，pre-post的变化趋势是一致的。primed基因亦是。不过一些多能性markers表达patterns因物种而异。举个栗子，STAT3和ZFP57等naïve 基因在猪Post EPI中表达水平低，人猴中并非如此，KLF2，DNMT3L和NANOG 在人猴post EPI表达低，猪中并非如此。EOMES、MIXL1和NODAL 等primed基因仅在猪中上调，而FGF2仅在人猴上调，接下来将猪EPI和人几个ips（rt2iLGoY-hiPSC、rNHSM-hiPSC 和primed hiPSC）进行整合比较。Pearson 表明rt2iLGoY-hiPSC 类似于人 E6 EPI，而primed hiPSC 类似于着床后人 E10 EPI。NHSM-hiPSC 更接近 E8，这种细胞介于其余两种ips中间。PCA显示，rt2iLGoY-hiPSC 介于猪 ICM/Pre-EPI 和 PostE-EPI 之间，NHSM-hiPSC 介于 PostE-EPI 和 PostL-EPI 之间， hiPSC 置于更靠近猪 PostL-EPI 。
代谢、表观和多能性转录调控的跨物种分析
早期胚胎发育中的代谢变化在物种间普遍存在。发育中的胚胎会经历具有快速变化的合成代谢和分解代谢需求的阶段，这就需要提升代谢的基本组分和相关通路的水平来满足这些需求。作者比较了氧化磷酸化和糖酵解基因的表达水平。他这里没有比较全通路基因，只选了几个。在猪猴中，氧化磷酸化在Post-EPI中下调，与之相反糖酵解上调（与癌症hallmarks联系可以得出，post-EPI需要大量快速能量以供胚胎迅速扩张的能量需求）。不过这一现象在人中变化不明显，可能是人胚in vitro的缘故（体外胚扩张速率非常慢）。尽管代谢模式相似，但某些基因的pattern不同。比如，OXPHO 相关基因STAT3、ATP6V1F和ATP6V1G3仅在猪post-EPI 下调，而ATP12A在人/猴后EPI 中特异性下调，猴子的 ESRRB表达水平比猪和人Post- EPI降低幅度大，糖酵解部分，ENO2、GPI和LDHA表达水平仅在猪post-EPI 上升，而GCK、PCK2和TPI1在猴和人post-EPI中特异性上调。
代谢与表观有着内在的联系，因为许多染色质修饰是由来自不同代谢途径的底物来驱动的。有研究表明代谢与多能性的表观调控存在联系（吴军15年NCB）。作者发现DNMT3A在人猴post-EPI中显著上调而猪没有，而TET2在猪post-EPI中下调幅度更大。有研究说PRC2（修饰H3K27me3） 的不同成分对应不同功能。在小鼠中，敲除Ezh2，不敲除Ezh21 会影响MEF的全局H3K27me2/3水平；hESCs在敲除不同PRC2成分后产生不同形态。作者发现，1.EZH2在猪post-EPI中下调，但在猴上调，2.EZH1 在人猴post-EPI中的上调比猪明显；3.SUZ12/EED 在人猴post-EPI中更显著下调。in vitro 人胚中，SUZ12、EED和EZH2 在post-EPI中没有啥显著变化。
作者探索了EPI发育过程中TF和辅因子的pattern。从TFDB上宕数据，和DEG去匹配。MBD、NF-YA和STAT TF 家族在猪 Pre-EPI 中富集，homeobox TF家族在人猴pre-EPI中特异高表达。GCM、COE、CUT和THAP TF 家族在人猴post-EPI中高表达，辅因子基因家族，包括nucleoplasmin, PCGF, PHF, and SET，富集于猪post-EPI，“Other CRF Vestigial like”辅因子家族在人猴post-EPI中高表达。
总结，人猪猴EPI糖酵解和氧化磷酸化总体相似，鉴定了一些物种特异辅因子。
EPI 中膜相关基因的跨物种分析
（这部分内容对应于种间嵌合的膜信号识别）
系统比较了405个膜蛋白相关基因的patterns，发现人猴相同，猪不同。作者确定了102个在猪post-EPI中特异表达的的基因，人猴有142个。免疫和炎症相关基因如CD86 和 TNFRSF17 在猪post-EPI中下调，反之，人猴中没有观察到这些变化。有研究表明，着床过程与母体对胎儿的免疫反应和炎症有关。这一结果表明，与人猴胚胎相比，不同的免疫反应或验证可能促进猪的着床过程（猪此时明显是没有附植的胚胎，要想得出这一结论，应该用E14的EPI才对）。G蛋白偶联受体活性相关基因包括F2R和GPR176在猴中上调，但在猪post-EPI中没有上调。此外，猪primed PSC markers CD79B 在猪post-EPI 中特异高表达，与最近研究相符。
在细胞黏附相关蛋白中,IL1B在猪post-EPI中上调，而FRAS1、ITGA7和PCDH7在猴post-EPI中上调。先前报道IL1B在猪早期胚胎发挥重要作用，进一步检查了其在四个时期的表达发现，IL1B 在E10 达到峰值，随后进行细胞通讯分析，与人猴post-EPI相比，确定了猪上两种与IL1B特异相关的互作，分别为 IL1 receptor_IL1B 和 IL1B_ADRB2。此外， CCL3_IDE 和 BDNF_SORT1 互作在猪post-EPI中亦存在。随后对人三个stage的PSC进行细胞通讯分析。EPI-PSCs/PSCs-EPI在不同阶段与EPI-EPI共享59%–82% 的互作。3种PSCs与猪EPIs的细胞间相互作用重叠率无显著差异，但各类型PSCs与不同阶段猪EPIs的细胞间相互作用具有特异性。
物种间缺乏细胞间通信可能是种间嵌合的障碍之一。为识别潜在的细胞间通讯不相容性，采用cellPhoneDB预测人猴猪的PostL-EPI 和 PostL-TE 间的信号。结果表明：
猪人猴中 Post-EPI (EPI-EPI) 各独有7、89、98对特异互作； 猪人猴Post-TE (TE-TE) 各独有 59、52 和 169 对特异互作； 猪人猴 post-EPI VS post-TE中各独有 27、54 和 132 对 特异互作； 猪人猴 post-TE VS post-EPI 中各独有 29、61 和 99 对 特异互作。
总的来说，人猴间的共享互作多于二者与猪的互作。将之进行GO/KEGG注释，结果表明，猪的独特互作在 TE-TE 中更丰富，在 EPI-TE 和 TE-EPI 中较少，在 EPI-EPI 中也不多。GO 分析表明，TE-TE 特异互作在细胞粘附、增殖和管形态功能相关等方面富集，表明滋养层细胞在球形和丝状胚经历了明显的细胞变化。KEGG表明PI3K-Akt 信号通路在 TE-EPI 和 TE-TE 互作中富集，而 TGF-β 信号通路和调节干细胞多能性的信号通路在 EPI-TE 和 TE-TE 互作富集。
哺乳动物的早期胚胎发生伴随着外胚层上皮化（epiblast epithelialization）和胞间紧密连接的形成。作者分析了细胞连接相关基因，尤其是紧密连接蛋白家族，随后发现CLDN4和CLDN6在三个物种中的表达水平都高于其他家族成员，表明这俩在哺乳动物早期发育过程中较保守；CLDN9和CLDN10 则仅在猪post-EPI 中上调，表明这些差异表达的蛋白可能阻碍了人PSC和猪EPI的紧密连接构建。
总结：从细胞黏附、表面受体、紧密连接蛋白基因出发探索影响嵌合的潜在因素。
TE发育的跨物种分析
（综述）虽然启动子宫附植的几个关键信号通路是保守的，但胚胎附植因物种而异。与具有“侵入性”附植过程的、具有血绒毛膜胎盘的灵长类动物不同，猪具有“非侵入性”附植过程的上皮绒毛胎盘。在着床过程中，通过滋养层增殖和组织，猪的孕胎延长以建立妊娠。这种延伸过程在灵长类动物中并不存在，这就可能会对猪胚内人PSC 的活性、增殖和分化产生负面影响。此外，胚外组织不仅是发育过程中营养和调节植入所必需的，而且在原肠胚形成前和原肠胚形成过程中也起着至关重要的作用。如，在小鼠中，胚外外胚层（extraembryonic ectoderm）通过BMP4和BMP4b 信号传导至近端外胚层（proximal epiblast），诱导小鼠胚胎近后端几个重要基因表达；胚外组织表达的Nodal（Lefty1 和 Cer1）和 Wnt（Dkk1）拮抗剂对小鼠胚胎发育有重要作用。
作者假设人PSC和猪胚外组织间的错误通讯影响嵌合体效率。对pre/post-TE 进行分析。pearson分析表明猪的相关弱于人猴间的相关，人猴post-TE更像；3D PCA显示，猪猴TE可以分为俩cluster，与人不同，仍将这一现象归因于人体外胚。为了避免体内外因素的影响，此处仅进行猪猴间的跨物种比较，确定了猪猴本身的特异DEGs，富集表明，猪 Post-TEs 中上调的基因在神经发生、几种发育通路，包括 Hippo、WNT 和 TGF-β 信号通路以及微管相关过程等条目富集；猴 Post-TE 中特异性上调的基因在迁移和血管生成相关方面富集；细胞周期和 DNA 复制途径相关基因在猪post-TE vs pre-TE 中特异上调，表明细胞快速增殖有助于猪TE 发育；相反，猴TE发育过程中这些基因的表达水平没有明显变化。为了证实这些变化是猪 TE 发育所特有的，分析这些细胞周期和 DNA 复制相关基因在猪和猴 EPI 中的表达pattern。结果表明，这些基因在猪psot-EPI 中也表现出物种特异性上调。
与人猴相比，猪有胚胎快速延伸这一过程，但机制不明。作者分析了猪猴Pre-TE 和 Post-TE 之间的 DEG。IL1B、BMP2/4/7、SPP1、SMAD5、FGF4和FGFR2 等基因与调节胚胎延长有关，它们在猪 Post-TE 中上调，猴中没有上调。此外，IL1B不仅在猪psot-TE上调，还在猴post-TE中下调，其表达在球形胚内TE达到峰值，随后逐渐下降，确认了该基因的靶基因，如IFNG、IL8、Spi1、MIB1，从pre -TE 到post -TE 过渡期间也显著上调。随后分析了一些配体受体互作，确定了几个胚胎延长关键事件。
因为钙粘蛋白可能影响轴突的生长和伸长，作者分析了猪猴TE 相关基因，结果表明，CDH2、CDH7和CDH11在猪 Post-TE 中特异上调，而CDH1和CDH5在猴 Post-TE 分别特异下调和上调。先前已报道CDH2和CDH11都参与轴突伸长，这一结果表明猪胚伸长具有轴突伸长的一些特征。
使用 CellPhoneDB 预测猪胚延长期间妊娠子宫上皮（管腔和腺体，P_LE 和 P_GE）与 PostL-EPI 或 PostL-TE 之间的配体-受体相互作用（作者没测这个啊？）。鉴定了一些特异互作。
总结：
简而言之就两块，EPI和TE：
EPI 探讨了多能性衰退、代谢和胞间信号的变化，同时进行了跨物种比较。
TE 探讨了DEG的相关通路，探讨了猪胚延长过程中的一些通路。
启发：
可以探讨更广泛谱系发育的基因动态变化，根据聚类定义时期，抹掉物种差异；可以做细胞信号识别。
人的in vivo 胚胎发育在2021年11月发了文章：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04158-y，可以参考，结合in vitro是否出现post 细胞分群。
空间转录组应用展望：近期预印本空间转录组文献精选 | 空间转录组专题
如果你对单细胞转录组研究感兴趣，但又不知道如何入门，也许你可以关注一下下面的课程
看完记得顺手点个“在看”哦！
长按扫码可关注