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单细胞核测序在人类肾脏上的应用

随便 单细胞天地 2022-06-07

呐,等你关注都等出蜘蛛网了~


当你的才华还撑不起你的野心时,请潜下心来,脚踏实地,跟着我们慢慢进步。不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了,通过文献速递这个栏目很幸运聚集了一些小伙伴携手共进,一起成长。


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单细胞转录组分析综述

单细胞入门-读一篇scRNA-seq综述


文章信息


今天介绍的文献于2019年6月27号发表在NC上,文章题目是:A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys 。



摘 · 要 


本文使用单核基于液滴的RNA测序(snDrop-Seq)解析了人类成年肾脏中30个不同的细胞群。明确了两个主要肾区域之间十个以上的肾单位区域分子过渡态,描述了与慢性肾病,糖尿病和高血压相关的细胞异性表达的基因。可能会提供新的治疗靶点。


 样品处理   


由于肾核膜在容易遭到损伤,所以新鲜解离和在干冰或-80°C冷冻的冷冻切片肾组织样品能够保留足够的核RNA水平。文章使用的是来自两个机构(Washington University and University of Michigan through KPMP con- sortium)的27个不同实验中15个不同个体的数据。


 质控   


  • 初级QC:仅包括具有> 400个非线粒体转录物的细胞条形码; 排除在<3细胞中检测到的或线粒体表达的转录物; 检测到> 400和<5000基因的细胞条形码用于下游分析

  • 二级QC:使用PAGODA2,应用 Gene/UMI filter去除偏离组趋势的低质量细胞核(置信区间<1E-10),然后将计数标准化为每个细胞核的总计数,并校正批次变异通过缩放每个基因的表达,使得批内表达平均与数据集范围的平均值匹配。

  • 然后通过2次t-SNE聚类,去掉超过30个簇的聚集少的细胞核。

  • 最终总共获得17,659个核,并且每个细胞核平均测到1082个转录本。


 聚类   


对于聚类可视化,使用使用PAGODA2识别的前150个主要组分,在Seurat(版本2.3.4)中进行均匀流形近似和投影(UMAP)尺寸减小。


 分型基因的挑选   


通过找到的marker gene将其划分细胞类型。



 疾病相关基因   


通过超过10000人的全基因组数据,找到与CKD和高血压风险的变异基因,并对肾脏进行了更为精细的分类。


 下游分析   


  SWNE  


具体的操作可参考:https://yanwu2014.github.io/swne/

文中使用的参数:alpha.exp = 1.8,snn.exp = 0.1,n_pull = 6,dist.use =“cosine”

 Trajectory Analyses 

使用的是Monocle (V2.6.4),具体步骤可以参考monocle官网 ,不过需要注意,目前monocle已经更新至monocle3


 临床意义   


本文对肾脏内的细胞类型进行高度详细的分子表征,这对于分析肾脏疾病的分子诊断和靶向治疗至关重要。同时该研究为创建分子和生理图谱提供了一个初步步骤,文章中的图谱描绘了解剖学上的肾单位组织,可以作为识别各种肾脏疾病偏差的重要参考。

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