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听说课程配笔记,学习无压力

刘小泽 单细胞天地 2022-06-06

课程笔记




粉丝:有单细胞线上课程吗?

小编:什么? 我们的单细胞转录组分析线上课程已经上线好久了,你们竟然都不知道吗,每篇推文后面的课程推荐没人看的吗,小编已哭晕在厕所

好了,戏演完了,下面郑重介绍下我们的单细胞线上课程:(详情戳下方链接) 

全网第一个单细胞转录组数据分析实战视频教程(预售第二波通知)

课程链接在:http://jm.grazy.cn/index/mulitcourse/detail.html?cid=53 


这个课程笔记栏目记录了学员们学习单细胞转录组课程的学习笔记

希望大家能有所收获!



 整个课程框架 


整个课程分为了5个单元,目前更新了3个单元,其中:

  • 第一单元为背景介绍,包括单细胞转录组近10年的发展历程,以及两大主流技术smart-seq2(力求检测到单个细胞的基因数量)和10x(追求检测到的细胞数量)的介绍;

  • 第二单元加入了常规转录组的分析流程;

  • 第三单元重点利用smart-seq2技术得到的结果,结合三个R包进行分析;未来第4个单元将会整合公共数据库(TCGA、METABRIC)以及文献中的数据集进行整合分析;

  • 最后一部分就是展望,介绍10X的数据分析



 蓬勃发展的单细胞转录组 


与普通bulk转录组最大的区别就是:普通的是以一群细胞为一个样本,最后得到结果是一个均值,而单细胞将精度提高,将一个细胞作为一个样本,从而可以看出细胞的异质性


目前单细胞领域文章发表量迅速升高,有的团队一年可以出8-9篇CNS,最著名就是北大的汤富酬教授研究发育生物学领域,另外肿瘤、免疫研究相关也十分火热

不管怎样,单细胞转录组数据到了生信工程师手中,即使生物背景知识可能不完全理解,但他确实可以通过数据分析去说明某些事情。

推荐一个网站:https://omictools.com/single-cell-rna-seq-category


首先原始数据产出就有两种主流途径:测更多的细胞(以10X为主打)和测更多的基因(以smart-seq2为主打);


然后数据就要经过一系列的质控才能开始上游分析,也就是预处理阶段 ,也是两种方法:UMI、ERCC。因为单细胞精度太高,每个细胞都是独特的,和普通的Bulk RNA-seq不同,材料不容易获得,不太好做重复,因此通过生物学重复来评价技术手段/数据质量的方法不靠谱。

  • UMI即unique molecular identifier,是一段随机序列,每一个DNA分子都有自己的UMI序列。可以大大降低PCR误差(比如:原来两个样本中某基因表达量相同,但是由于两个样本扩增效率不同,样本1为99%,样本2只有95%,那么同时扩增40个循环,这同一个基因就有了0.99^40 / 0.95^40 = 5.2倍差异,因此本来没有差异也会因为外界因素扩增效率的影响而产生“假阳性”);设计不同标签的数量,大大超过待扩增的转录本,产生独特标记的分子,并允许控制扩增偏差【例如10-mer的UMI,就会有 4的十次方 约等于100万种变化】

  • ERCC就是外源RNA对照联盟开发的人工设计好的已知序列和数量的mRNA,高的ERCC含量与低质量数据相关,并且通常是排除的标准

关于QC的注意点:
QC不是仅仅对于下机的fq数据有效,它要在每一个分析环节都有体现。
主要包括:

  • 一般的diagnostic plots: GC content, adapter, kmer, duplicated, base pair quality

  • mapping reads/rate

  • total sequencing reads (library size)

  • the number of detected genes:检测dropouts,也就是实际有表达却没被检测到的基因

  • ERCC spike-ins content

  • the percentage of housekeeping genes, cell cycle genes, highly expressed genes, mitochondrial genes

  • overall gene expression patterns


质控的表达矩阵要进行归一化,因为不同的细胞有不同特征,另外实验条件也不同;这对于解释单细胞数据是至关重要的。单细胞的样本量相比bulk实在小太多,因此更容易引入技术噪音,这个必须去除;

加入了降维这重要的一步,因为细胞数量太多,也就是要分析的样本数量要几百甚至几千,于是会产生几百或几千的维度(可以试想一下常见的三维、四维空间);

找差异基因、找marker基因(和差异基因不同,它不需要有差异,只需要有重要的生物学意义)、根据基因重要性进行细胞分群


 文献 


   构建文库  



综述:Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. 2017,  (doi: 10.1016/j.molcel.2017.01.023.)

涉及到了6中文库构建方法(CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq, SCRB-
seq, Smart-seq, and Smart-seq2),可以再结合相关的每一个文库找6篇文章


文章发现:Smart-seq2可以在每个细胞中找到最多的基因,同样费用比较高;检测少量细胞时,MARS-seq、SCRB-seq、Smart-seq2更有效



   归一化  


文献1:Assessment of Single Cell RNA-Seq Normalization Methods,2017 (doi: 10.1534/g3.117.040683)


评价了几种归一化方法:

  • fragments per kilobase of transcript per million mapped
    reads (FPKM)(Mortazavi et al., 2008)

  • upper quartile (UQ)(Bullard et al., 2010)

  • Trimmed mean of M-values (TMM)(Robinson and Oshlack, 2010)

  • DESeq(Love et al.,2014)

  • removed unwanted variation (RUV)(Risso et al., 2014)

  • gamma regression model (GRM)(Ding et al., 2015).


文献2:Performance Assessment and Selection of Normalization Procedures for Single-Cell RNA-Seq, 2019 (DOI:https://doi.org/10.1016/j.cels.2019.03.010)


主要研究了scone方法:a flexible framework for assessing performance based
on a comprehensive panel of data-driven metrics

(http://bioconductor.org/packages/scone/)

另外方法还有很多,比如:LSF(Lun Sum Factors),BigNorm, Scnorm, BASiCS, RLE(size factor relative log expression)


   降维    


PDF: https://lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/002/349/740/RUG01-002349740_2017_0001_AC.pdf 值得好好阅读,讲了许多关于降维原理和应用的知识

文中1.5.1部分(Clustering high-dimension to identify subtypes)写出:

Importantly, the reduced dimensionality data are less noisy than the high-dimensional data bust lose some of the biological variance.


文章1:PCA, MDS, k-means, Hierarchical clustering and heatmap.


文章2:Outlier Preservation by Dimensionality Reduction Techniques
"MDS best choice for preserving outliers, PCA for variance, & T-SNE for clusters"


鉴定细胞群


每个术语都对应一篇文献

  • 降维:PCA、tSNE、DM(Diffusion maps)

  • feature selection:M3Drop(Michaelis-Menten Modelling of Dropouts)、HVG(Highly variable genes)、Spike-in based methods、Correalated expression

  • Seurat:is an R package designed for the analysis and visualization of single cell RNA-seq data. It contains easy-to-use implementations of commonly used analytical techniques, including the identification of highly variable genes, dimensionality reduction (PCA, ICA, t-SNE), standard unsupervised clustering algorithms (density clustering, hierarchical clustering, k-means), and the discovery of differentially expressed genes and markers.

  • SC3:SC3 achieves high accuracy and robustness by consistently integrating different clustering solutions through a consensus approach. Tests on twelve published datasets show that SC3 outperforms five existing methods while remaining scalable, as shown by the analysis of a large dataset containing 44,808 cells. Moreover, an interactive graphical implementation makes SC3 accessible to a wide audience of users, and SC3 aids biological interpretation by identifying marker genes, differentially expressed genes and outlier cells.

  • tSNE+kmeans

  • SNN-Clip: doi: 10.1093/bioinformatics/btv088

  • SINCERA: SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis.


综述:A systematic performance evaluation of clustering methods for single-cell RNA-seq data (SC3 and Seurat show the most favorable results)

关于各种单细胞工具:https://www.scrna-tools.org/
文章在:Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database



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