全世界约2.57亿人正遭受着乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染的困扰，其中大约1/3的感染者在中国。据2018年统计数据显示，我国在新发感染人数小幅度下降的情况下，乙型肝炎患者依旧在100万以上。HBV感染的防控仍是我国面临的一个重大公共卫生问题。HBV属于嗜肝DNA病毒，主要感染人的肝细胞，其慢性感染可导致慢性乙型病毒性肝炎（简称慢性乙肝），并可显著提高肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的发病率（图1）。然而，目前并没有药物可以有效清除感染病毒，只能通过提前注射疫苗来防止感染。

图1 三步曲：肝炎、肝硬化、肝癌

HBV慢性感染难以治愈的原因主要有两方面：

1、HBV感染产生的共价闭合环状DNA（covalently closed circularDNA, cccDNA）难以清除，持续存在。

2、HBV DNA可部分整合到人的基因组，稳定存在。

乙肝病毒基因组整合的研究进展

HBV线性双链DNA（double-stranded linear DNA, dslDNA）是HBV DNA整合的主要分子。dslDNA主要由HBV正义链 (+)-DNA的异常原位起始延伸产生（图2）。

图2 HBV dslDNA的合成过程

dslDNA在底物整合进细胞的基因组之前，可能需要经过以下加工过程（图3）：

1.去除(-)-DNA 5’端共价结合的HBV聚合酶蛋白（Pol）

2. 去除(+)-DNA 5’端的Cap结构

3. 补齐 (+)-DNA

细胞基因组双链断裂的位置被认为是HBV DNA整合插入的主要位点，非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ）和微同源介导的末端连接（microhomology-mediated end joining, MMEJ）被认为参与了HBV DNA整合插入的过程（图3）。

图3 HBV dslDNA整合机制示意图

HBV DNA整合的相关研究模型

HBV DNA整合的现象在1980年首次被报道，当时采用的检测方法为Southern blot杂交。在之后40年的研究进程中，检测方法不断发展，主要有以下几种：

1. Southern blot杂交

2. 原位杂交

  （In Situ Hybridization）

3. 克隆构建及测序

  （Cloning and Nucleotide Sequencing）

4.  聚合酶链式反应

  （Polymerase Chain Reaction, PCR)

5. 高通量测序技术

  （High-Throughput Sequencing Technology）

HBV DNA整合的相关研究模型

目前我们对HBV DNA整合的认知主要来源于两方面研究：HBV感染患者肝组织样品；其他嗜肝DNA病毒的非灵长类动物模型，如土拨鼠肝炎病毒感染土拨鼠的动物模型，鸭HBV感染鸭的动物模型。但随着HBV受体人牛磺胆酸酸钠共转移多肽（human sodium taurocholate cotransportingpolypeptide, hNTCP）被发现，一系列可支持HBV感染的细胞及动物模型被建立，这些新型的模型势必对HBV DNA整合的研究带来极大的便利和促进。

目前支持HBV感染的模型主要有以下几种：

细胞模型：

1.人原代肝细胞（Primary Human Hepatocytes, PHH）

2. 人肝干细胞系HepaRG及其hNTCP稳转细胞系（HepaRG-hNTCP）

3. hNTCP稳转人肝癌细胞系，如HepG2-hNTCP和Huh7-hNTCP细胞系

4.干细胞分化的肝细胞

动物模型：

1.黑猩猩

2. 表达hNTCP的猕猴

3. 树鼩

4. 人肝嵌合小鼠

HBV DNA整合在肝细胞癌中的作用

慢性HBV感染被认为是肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）发生的一个重要风险因素。有研究指出乙肝患者发生肝癌的几率比未感染者高10-200倍，而HBV DNA整合在此过程中发挥着重要作用。与癌旁组织相比，HBV DNA的整合频率在肝癌细胞中更高（86.4% vs 30.7%）。HBV DNA整合在HCC的发生发展中所起作用的分子机制主要有以下几个方面：

1.插入突变，导致HCC相关基因的异常表达

2.破坏染色体的稳定性

3. HBV DNA部分整合导致截短或与宿主蛋白融合的病毒蛋白产生，导致细胞生理特性的改变及相关的病变，如全长或截短的HBsAg及HBx。

目前HBV治疗的目标是获得“功能性治愈”，即停止用药后，血清中持续检测不到HBV DNA；HBsAg的消失，伴随或不伴随HBsAg抗体的产生；正常的肝功能及组织形态。整合到细胞基因组中的HBV DNA可作为HBsAg产生的稳定模板，从而阻碍“功能性治愈”的实现。针对整合HBV DNA所转录出的转录本设计的siRNA相关药物，可能会对降低患者体内的HBsAg水平起到积极的作用。

总结与展望

在乙肝病毒被发现的55年里，科研人员对HBV DNA整合的研究取得了一定进展，但仍有一些问题亟待解决，如HBV DNA整合的具体分子机制，在HCC发生发展中的具体作用及机制等。新型HBV感染模型的建立将会对HBV DNA整合的研究带来极大的便利和促进。HBV DNA整合应作为一种临床检测指标，用来综合全面地评估HBV患者的疾病发生发展风险。为降低HBV DNA整合对HBV患者疾病的影响，需要重视针对HBV DNA整合的治疗手段及药物研发。同时降低患者肝细胞中cccDNA含量及削弱整合HBV DNA所带来的影响，将会更加有利于HBV“功能性治愈”的实现。

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原文链接：https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(20)30034-5

本文内容来自 Cell Press 合作期刊 The Innovation 第二期发表的Review文章“Insights into Hepatitis B Virus DNA Integration-55 Years after Virus Discovery” (投稿：2020-05-27；接收：2020-07-27；在线刊出：2020-08-28；DOI:https://doi.org/10.1016/j.xinn.2020.100034)

作者简介

武汉大学基础医学院博士后赵凯涛为本文第一作者；武汉大学基础医学院夏宇尘教授为本文通讯作者。

夏宇尘：

武汉大学病毒学国家重点实验室/基础医学院教授，博士生导师，主要从事乙型肝炎病毒的基础和转化相关研究，研究成果相继发表于Science、Gastroenterology、Journal of Hepatology、Hepatology、Journal of Clinical Investigation、Journal of Virology等学术期刊。

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The Innovation 是由一百多位青年科学家发起成立的综合性英文期刊，与 Cell Press 合作出版，期刊内容覆盖所有自然科学。2020年5月21日首刊出版（点击查看），2020年8月28日第二期出版（点击查看）。

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