空间转录组遇到的那些坑——空间转录组图像处理

本文详细介绍10x Genomics公司空间转录组产品图像处理。

示例数据：10x Genomics官方示例数据小鼠脑切片组织图像。

软件：Adobe Photoshop、Loupe Browser。

处理：从10x官方下载图像文件，如图1所示，此图像文件很大（283M），因此用Adobe Photoshop打开比较方便。

图像文件见图2。空间转录组切片原始图像文件都比较大，像素维度大小一般都在20000px以上。

图2. 图像文件

打开图像后首先检测切片组织是否覆盖4个基准点（图2中红框标记部分），此样本图像未覆盖基准点，但部分组织与基准框重叠（影响：此部分组织无法进行下游分析，无法处理）。

综合观察样本图像数据比较良好，一般没必要修改。如果下游分析有特殊要求，如对样本组织特定区域的spot感兴趣想单独拿出来分析，可以将图像旋转，将此图像右上角的沙漏型基准点位于左上角，因为沙漏型基准点相当于坐标原点，位于左上角方便标记spot的坐标，后续分析比较省事。如图3所示将此图像逆时针旋转90度，然后另存为tif格式，保存时记得压缩，结果如图4。

图3. 图像旋转处理

图4. 变换后的图像文件

当然，现实中我们也会遇到组织覆盖基准点的情况，上游分析SpaceRanger的自动图像检测算法可能会出现基准点对齐失败的情况（检查上游分析结果中web_summary.html的右上角图像或者aligned_fiducials.jpg的基准点是否对齐）,如果基准点没有对齐就需要Loupe Browser软件处理。

首先打开Loupe Browser软件，首页如图5所示，点击右下角Open Wizard。开始导入数据，图像数据路径不要包含中文字符，加载完图像数据之后在右下角填写玻片序列号及区域，详细见图6。

图5. Loupe Browser首页

图6. Loupe Browser导入数据

根据左边提供的基准点去右边图像区域点击对应的基准点，见图7，依次对齐4个基准点，结果见图8。下一步选择组织区域的spot。

图7. Loupe Browser基准点比对 

图8. Loupe Browser基准点比对结果 

将样本切片覆盖的spot标记为组织，此操作较为繁琐，先使用套索工具选出大概组织范围，再去调整单个spot的属性。结果如图9所示。

图9. Loupe Browser识别组织结果

最后如图10导出结果，生成json文件。上游分析SpaceRanger count添加参数 --loupe-alignment=xxx.json即可。

图10. Loupe Browser导出结果

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