今天小编为各位老师带来一篇单细胞技术在肺腺癌研究中的应用。这篇文章利用10X单细胞技术，对44名患者的正常组织、早期至转移性肺腺癌的样本进行分析，发现了偏离正常分化轨迹并在转移期占主导地位的癌细胞亚型，同时发现在癌症发展的所有阶段，基质和免疫细胞显示出促进肿瘤发生发展和抑制免疫微环境的功能变化。这篇文章证明了同时研究癌症和免疫微环境有利于发现肿瘤潜在的诊断和治疗靶点。百迈客单细胞免疫组库测序产品基于10x Genomics平台的微流控和油滴包裹技术，在单细胞水平同时检测转录组基因表达和TCR/BCR多样性，不但可以了解TCR/BCR克隆型，还可以联合转录组数据深入挖掘生命机理，一套数据两种用途，为免疫组学研究提供更高效的平台，在肿瘤微环境、感染性疾病、自身免疫疾病等研究领域有着广泛的应用前景。目前百迈客单细胞免疫组库产品已升级到2.0版本，使用chipK芯片和dual index，检测灵敏度、覆盖度和匹配率更高，错配率更低。技术原理如下图：
非小细胞肺癌（NSCLC）在组织学上分为腺癌、鳞癌和大细胞癌。 肺腺癌（LUAD）是最常见的类型，约占所有非小细胞肺癌的40%。LUAD通常在转移阶段被检测到，常转移到脑、骨骼和呼吸系统，并且远端转移是肺癌死亡的主要原因，然而目前对于转移性肺癌及其相关微环境的研究仍然很少。为了解肺癌进展和转移，前期主要集中在研究癌细胞突变上，然而，肺癌的进展和转移也受到肿瘤微环境的影响。例如，利用免疫检查点抑制剂抑制 PD-1和 CTLA-4为治疗转移性NSCLC打开了新的治疗方式。 因此，解析晚期癌症中独特的肿瘤微环境可以揭示参与肿瘤诱导免疫微环境变化的关键要素，这些要素可用于新的免疫治疗策略中。单细胞测序允许在转录组水平上对数千个细胞进行大规模检测。之前与肺癌相关的研究都是用混合组织学类型的患者的早期原发灶和正常组织，但本研究是对LUAD患者的原发灶和远端转移灶进行了全面的单细胞转录组分析，并揭示了与肿瘤进展相关的细胞动力学和分子特征。患者标本
本研究已获得伦理委员会（IRB）的审查和批准（IRB编号 2010-04-039-052），所有受试者均已签署书面知情同意书。本研究招募了44名病理诊断为LUAD的患者，平均年龄62.2岁，其中38.6%为女性，共收集了58个样本用于单细胞分离。肿瘤组织、正常肺组织、正常淋巴结和转移性脑组织来自在三星医疗中心（韩国首尔）接受手术治疗的初治LUAD患者，正常肺组织与恶性区域至少相隔5 cm。通过支气管内超声和支气管镜检从晚期LUAD患者中收集淋巴结和肺肿瘤组织，并收集LUAD患者胸水。另外收集了3名LUAD患者的6个组织样本（肿瘤-正常对），并进行流式细胞分离。收集的组织如下：LUNG_T14（IIIA期）、LUNG_N14、LUNG_T41（IIIA期）、LUNG_N41、LUNG_T42（IA期）、LUNG_N42、LUNG_T43（IB期）、LUNG_N43。
样本制备
在手术后16 h内通过机械解离和酶消化收集到的组织制备单细胞悬液。单细胞分离方式因样品条件而异。（1）使用肿瘤分离试剂盒（Miltenyi Biotech，Germany）按照制造商的说明进行肿瘤和远处正常肺组织的分离。将组织切成 2-4 mm的碎片，转移到含有酶混合物（含酶H、R和A的RPMI1640培养基）的C管中，37 °C 在MACSmix旋转器上孵育30 min。（2）使用胶原酶/透明质酸酶（STEMCELL Technologies，Vancouver，Canada）和DNase I，RNase-Free（QIAGEN，Hilden，Germany）分离正常淋巴结组织、淋巴结转移灶和肺肿瘤组织的活检样本。使用无菌剪刀将组织切成 2-4 mm的碎片，放置在 35 mm的培养皿中，并在酶溶液（胶原酶/透明质酸酶（STEMCELL Technologies，Vancouver，Canada）和 DNase I，RNase-Free（QIAGEN，Hilden, Germany）的RPMI1640 培养基中 37°C 培养1 h。（3）用无菌剪刀将脑转移灶组织切成2-4mm，置于100-mm培养皿中，并在37°C下酶溶液（胶原酶（Gibco，Waltham，MA，USA）， DNase I（Roche，Basel，Switzerland）和 Dispase I（Gibco，Waltham，MA，USA）；在DMEM 中制备）中保持 1 h。（4）将胸水转移至50 ml管中，300g离心细胞。在通过70 μm过滤器后，将单细胞悬液转移到新的 50 ml（活检样本为 15 ml ）管中， 用RPMI1640培养基将管中的体积重新调整至50 ml（或 15 ml），并将内容物离心以去除酶。吸出上清液，将细胞沉淀重悬于4 ml RPMI1640培养基中，并使用Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare，Chicago， IL，USA) 分离去除死细胞。
单细胞RNA测序和数据处理
使用10x Genomics仪器对单细胞悬液进行 3' RNA测序，预计捕获5000个细胞。文库在 Illumina HiSeq2500上测序，并使用Cell Ranger工具包（2.1.0 版）分析下机数据，使用人类GRCh38参考基因组。为了阐明 LUAD 进展中的细胞动力学，通过支气管内超声/支气管镜活检或手术切除，从44名未经治疗的LUAD 患者中获得了来自原发肺组织、胸水、淋巴结或脑转移的肿瘤组织（图 1a），还收集了远处的正常组织或淋巴结用于比较分析。将208,506个细胞分为9个不同的细胞群，用marker基因进行注释（图 1b-d），上皮细胞（肺泡和癌细胞）、基质（成纤维细胞和内皮细胞）和免疫细胞（T、NK、B、髓细胞和 MAST 细胞）为常见的细胞类型，少突胶质细胞仅在脑转移瘤（mBrain）中。由于组织解离过程中引入的偏差，与基质和上皮细胞类型相比，单细胞RNA测序中免疫细胞的比例偏高，因此，本研究去除上皮和基质细胞群后评估了免疫细胞亚群的组成，结果再现了早期LUAD中通过CyTOF质谱法检测到的免疫细胞群，并发现肿瘤原发灶中最丰富的免疫细胞是T淋巴细胞和骨髓细胞。与正常肺组织（nLung）相比，早期和晚期肺癌（分别为tLung 和tL/B）中T和B淋巴细胞出现富集，而NK细胞和骨髓细胞减少，表明适应性免疫反应的激活。值得注意的是，与正常淋巴结（nLN）不同，转移性淋巴结（mLN）含有大量骨髓细胞，表明骨髓浸润与转移有关。mBrain样本包含免疫细胞（T、B 和 NK 细胞）、常驻少突胶质细胞、髓样细胞（小胶质细胞），这些细胞显示出组织特异性，以及肿瘤生长和侵袭造成的总体变化。因此，本研究绘制的LUAD图谱以前所未有的规模和深度揭示了每个细胞群与疾病进展相关的细胞动力学。
图1 LUAD患者208,506 个细胞的分析和聚类
2、与LUAD进展相关的肿瘤内在特征
构建肿瘤组织和正常组织上皮细胞的分化轨迹（图 2a），揭示与肿瘤进展相关的细胞分化路径。首先，纤毛上皮细胞和肺泡细胞位于不同的轨迹分支中，标志着它们不同的分化状态。其次，棒状细胞位于纤毛和肺泡分支之间，表明它是一个中间分化状态。最后，肿瘤细胞形成分支，沿着正常上皮细胞有两种转录状态（tS1和tS3），并观察到一个转录状态（tS2）明显位于tS1和tS3分支的末端（图2a，b）。为了识别细胞轨迹特征，本研究在肿瘤细胞特征1、2、3（tS1、tS2、tS3）或正常细胞特征1、2、3（nS1、 nS2、nS3）中找到了特定于每个肿瘤或正常细胞状态的差异表达基因，大多数S1和S3相关基因在肿瘤和正常细胞之间共有但受到差异调节，并且与维持表面活性物质稳态、肺泡发育和纤毛运动的正常上皮功能有关（图 2c）。相比之下，S2相关基因显示出明确的肿瘤导向特征，例如细胞侵袭性和异常增殖或凋亡。因此，tS1和tS3细胞特征代表正常分化程序的失调，而tS2细胞特征代表完全偏离正常转录程序。LUAD患者同时包含不同的tS1和tS2肿瘤亚群，以及少量的 tS3（图 2d，tLung）。从晚期活检组织或转移组织（tL/B、mLN 和 mBrain）中分离的肿瘤细胞中的tS2特异性基因表达增加，表明tS2与肿瘤进展和转移相关（图 2e），并通过LUAD样品的免疫组化分析，在蛋白质水平证实了tS2特异性基因表达的增加（图 2f）。使用TCGA数据库的独立LUAD队列进一步证实了tS2特征的临床影响，具有高tS2特征基因表达的患者显示出比低表达患者更差的总体生存率（p < 0.01）（图 2g）。相比之下，肺鳞癌患者（LUSC）没有生存差异，表明tS2特征仅参与LUAD的进展。
图2 LUAD中新型癌细胞特征tS2的鉴定以及与患者生存率的关系
3、基质细胞参与组织重塑和血管生成
为了研究肿瘤微环境中的基质细胞动力学，本研究获得了6168个成纤维细胞和内皮细胞，如图1b所示，根据代表性marker基因的表达（平均对数标准化表达>1）将细胞分为2107个内皮细胞和3794个成纤维细胞。内皮细胞（EC）亚群分为8个簇（图3a）。大多数EC细胞亚群属于正常组织，是已知的血管细胞类型，包括Tip−like ECs细胞和Stalk−like ECs细胞、淋巴EC细胞和内皮祖细胞（图 3b）。相比之下，在tLung和mBrain样本中鉴定到一个不同的细胞亚群，为肿瘤来源的ECs（EC-C1）（图 3c）。肿瘤内皮细胞显示出VEGF和Notch的强烈信号（图 3b），其能够调节内皮细胞的发育，决定细胞命运。肿瘤ECs的基因表达网络分析进一步确定了与血管生成功能相关的基因上调表达（图3d），证明脑转移灶和原发灶诱导了类似的血管变化以适应广泛的新血管形成。值得注意的是，肿瘤ECs中显著下调的基因与免疫激活有关（图 3d），这与之前的研究一致，即肿瘤ECs抑制免疫反应。成纤维细胞的亚群显示12个不同的簇，共7种已知的细胞类型，包括COL13A1+和COL14A1+基质成纤维细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞、间皮细胞、mBrain中的成纤维细胞样细胞和周细胞（图 3e）。COL13A1+和COL14A1+基质成纤维细胞是正常肺（FB-C0 和 6）和早期肿瘤（FB-C1 和 2）组织中的主要成纤维细胞类型（图 3f，g）。相比之下，FB-C3中的肌成纤维细胞仅来源于肿瘤组织，包括tLung、tL/B和mLN。肌成纤维细胞被看做为与癌症相关的成纤维细胞，促进组织重塑、血管生成和肿瘤进展。mLN中的肌成纤维细胞可能是网状细胞，据报道它们是免疫学上特化的肌成纤维细胞，使用间充质海绵将免疫细胞聚集到淋巴结中。mBrain中的成纤维细胞样细胞（图 3f，g；FB-C7；CYP1B1+和APOD+）可能代表中枢神经系统（CNS）血管周围空间内的细胞，这些细胞在CNS损伤后扩张。通过标记α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（ACTA2基因产物）在肿瘤基质（图3h）和肿瘤衍生的EPCAM-CD45-细胞中的表达证实了LUAD中肌成纤维细胞的浸润（图3i，j），在正常组织的血管平滑肌细胞中检测到部分α-SMA蛋白的表达。总之，内皮细胞和成纤维细胞的细胞动力学支持基质细胞向促进 LUAD 和远端转移中的组织重塑和血管生成的表型转变。
图3 肿瘤内皮细胞和肌成纤维细胞促进血管生成和组织重塑
骨髓细胞在维持组织稳态和调节肺部炎症方面发挥着关键作用。如图 1b 所示，42,245个骨髓细胞的亚群包括单核细胞、巨噬细胞和树突细胞（图 4a、b）。已知两种巨噬细胞类型存在于正常成人肺中，包括高度表达MARCO、FABP4和MCEMP1基因的肺泡（AM）类型，以及源自循环单核细胞的间质类型，在功能上不同于组织驻留巨噬细胞的Mo-Macs在肺纤维化过程中被诱导表达促纤维化基因。本研究检测正常肺组织中的AM类型，包括抗炎AM（M-C1和6；APOE+、CD163+和C1QB+）、促炎AM（M-C5；IL1B+和CXCL8+）和主动循环AM （M-C13）。相比之下，肺肿瘤组织和远端转移组织中mo-Macs（分别为M-C0和2中的抗炎和促炎mo-Macs）高度富集。正常和肿瘤组织均含有S100A9+单核细胞（M-C3）或树突状细胞（DC），其余的细胞簇显示出特定起源的异质性和不同的巨噬细胞特征，包括来自胸水（PE）的胸膜巨噬细胞（M-C8 和 9）或来自mBrain样本（M-C11）的小胶质细胞和巨噬细胞。胸膜巨噬细胞缺乏促炎细胞因子基因的表达，如IL1B和CXCL8，但表达与非炎症表型相关的CD163。总体而言，本研究数据表明，原发性肺肿瘤组织和远端转移组织相关的巨噬细胞（TAM）主要从与组织驻留巨噬细胞本体不同的mo-Mac传播（图 4c）。树突细胞（如图 4b）表现出多样化的marker基因表达，表明存在异质DC亚群。为了进行更全面的分析，本研究将DCs重新分为6个亚群，包括CD1c+ DCs（Langerhans cells，LCs）、CD141+ DCs、CD207+CD1a+ LCs、pDCs（浆细胞样 DCs）、CD163+CD14+ DCs 和激活的 DCs（图 4d，e），这一分类完善了骨髓细胞簇内的DC细胞亚群分类（图 4f）。有趣的是，在正常肺组织中几乎没有pDC，但在选定的肿瘤组织和转移淋巴结中存在（图 4g，h）。pDC表现出免疫抑制表型，表现为白细胞免疫球蛋白样受体（LILR）家族基因的上调、颗粒酶B（GZMB）的产生以及CD86、CD83、CD80和LAMP3激活标记表达的丧失（图 4i）。通过流式细胞术证实了一些LUAD组织中特有的pDC（图 4j，k），因此，mo-Macs和pDCs都可以创造一个免疫抑制微环境，这可能会导致LUAD和远处转移中的肿瘤抗原呈递不理想。
图4 骨髓细胞谱系和功能的多样性
5、适应性免疫激活
在淋巴结中存在大量B细胞，27,657 个B细胞分为14 个亚型（图 5a），共5种分化状态，分别为滤泡 B 细胞、表达免疫球蛋白γ（IgG）的浆 B 细胞、表达免疫球蛋白γ (IgG) 的黏膜相关淋巴组织来源的浆B细胞、分泌颗粒酶B的B细胞和生发中心（GC） B细胞（图 5a）。在所有样品中观察到滤泡B细胞是最丰富的（图 5b）。正常肺组织富含分泌颗粒酶 B 的细胞毒性细胞，其分化受 T 细胞来源的IL-12调节，这些细胞分泌的颗粒酶 B 可以作为 T 细胞的替代品，在介导细胞毒性方面发挥重要作用。分别在原发肿瘤和LN转移灶中发现了比在正常肺和淋巴结中更多的GC B细胞。这些数据表明一些LUAD患者的体液免疫反应高度激活，每个B细胞亚型显示出略有不同的B细胞受体或Ig轻链可变基因表达谱，表明肿瘤抗原特异性B细胞的产生和克隆扩增。T淋巴细胞是介导抗肿瘤免疫的核心参与者，也是免疫检查点疗法的靶点。从具有共同转录组特征的T和NK细胞群（图 1b）中收集了91,227个细胞，并使用marker基因（平均对数归一化表达式 >2）对T淋巴细胞的亚群进行分析。T/NK细胞亚群分为CD8+ T（幼稚、效应、衰竭）、幼稚CD4+ T、衰竭T滤泡辅助细胞、T辅助细胞、调节性T细胞和NK细胞（图 5c），发现与正常组织相比，原发肿瘤组织表现为NK细胞的消耗和调节性T细胞（Tregs）的出现（图 5d）。Treg细胞在tL/B、mLN和mBrain中均存在，在肿瘤进展和转移过程中产生抗肿瘤免疫的抑制机制。CD8+ T细胞表现出动态变化，如会转录成幼稚、细胞毒性或耗竭T细胞（图 5e、f），耗竭CD8+ T细胞主要在肿瘤组织（tLung、tL/B、mLN和mBrain）中，而细胞毒性效应CD8+ T细胞则主要在nLung 中（图 5g），幼稚CD8+ T细胞主要来自nLN和PE。传统的流式细胞分离进一步证明了原发性肿瘤和正常肺组织之间 T/NK 细胞亚群动力学（NK、Treg 和细胞毒性或耗竭CD8+T 细胞）的差异（图 5h）。总之，T细胞的细胞群组成和基因表达的变化证实了LUAD中肿瘤免疫向免疫抑制的方向变化。
图5 肺癌进展过程中B细胞和T/NK细胞介导的免疫反应
原文链接
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32385277
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文：yuc
排版：市场部
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