英文题目：Single-Cell RNA Sequencing Reveals mRNA Splice Isoform Switching during Kidney Development
发表杂志：Journal of the American Society of Nephrology
影响因子：9.274
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32651222/
在哺乳动物肾脏发育过程中，肾单位前体细胞经历间质到上皮的转变，最终分化为肾单位的不同管段。最近，Drop-Seq单细胞RNA测序技术用于测量数千个单个细胞的基因表达，识别出发育中的肾脏中不同的细胞类型。然而，这项分析并没有包括可供选择的mRNA剪接所产生的额外的异质性。
采用全长单细胞RNA测序技术对544个小鼠胚胎肾脏单个细胞的转录本进行分析。用全长单细胞RNA测序测定的基因表达水平确定了每种细胞类型。进一步的分析全面描述了间充质细胞和上皮细胞状态转换过程中的剪接异构体转换，这是肾脏发育过程中的一个关键的转换过程。这项研究还确定了几个假定的剪接调控因子，包括基因Esrp1/2和RBFOX1/2。
胎儿肾间充质分化为肾小管上皮过程中可选择性剪接的多组基因的发现将提高我们对驱动肾脏发育的分子机制的理解。
关键词：选择性剪接；间充质向上皮转变(MET)；单细胞RNA测序；Wt1；肾脏发育。
图1 A 实验流程图
一、利用基因表达水平将每个细胞类型进行注释，这些细胞类型共存于发育中的小鼠胚胎肾脏的肾生化区 本文从表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因小鼠胚胎中收集肾脏(图1A)。在妊娠第18.5天收集肾脏，在肾脏分离后，使用流式细胞仪富集了高表达Six2-gfp转基因的288个细胞和表达低水平Six2-GFP转基因的288个细胞，并对每个单个细胞使用Smartseq2方案进行了全长单细胞RNA测序。
基于文献中先前被证明是每个细胞群体特有的基因的表达水平，以及一般上皮标志物和指示细胞分裂的基因，本文手动地将每个细胞进行分类(图2A)。这些结构包括非诱导间充质(UM)、帽间充质(CM)、足细胞(PODO)、早期上皮结构(PROX_1)、近端上皮小管(PROX_2)、Henle环(LOH)、远端小管和集合管(Dist_CD)、内皮细胞(Endo)和浸润的免疫细胞。在确定了不同的细胞亚群后，本文检查了已知在细胞分裂过程中过度表达的基因Mki67和Top2a的表达水平。本文发现UM、CM、PROX_1、LOH和DIST_CD都含有大量过表达这些基因的分裂细胞子集，而PODOS和PROX_2则不表达这些基因。此外，本文发现CM的细胞在基因表达空间中创建了一个圆形流形(即一个高维的环)，其片段对应于细胞周期的不同阶段(图2B)。
接下来，本文检查了已知参与MET的基因或已知在间充质或上皮细胞系10、12、47中优先过表达的基因的表达水平(图2C和D)。本文观察到间充质相关基因如SNAI2、CDH11和Cdh2在早期发育谱系UM和CM中的高水平表达。同样，较高水平的上皮基因如Cdh6、Cdh1和EpCAM在分化程度较高的谱系中普遍存在：早期上皮结构(Prox_1)、Prox_2、LOH和Dist_CD。本文注意到CDH11的表达呈逐渐下降的趋势(图2C，补充附录1中的图S12)，UM表达最高，CM表达中等，PODO表达较低，上皮细胞(Prox_1和Prox_2)表达很低。同样，当比较Cdh6和Cdh1(图2D)时，本文注意到Cdh6在早期上皮结构(Prox_1)和prox_2中较高，而Cdh1在LOH和dist_CD中较高。
图3 间充质相关基因的表达水平
二、用rMATS检测在表征肾脏发育过程中间充质和上皮细胞状态转换过程中，发生的剪接异构体转换事件 接下来，本文使用完整的转录本长度序列信息来表征肾脏发育过程中MET过程中发生的剪接异构体转换。本文在UM或CM间充质细胞和所有上皮细胞PROX_1、PROX_2、LOH和DIST_CD之间寻找包涵体水平显著变化(FDR=0，包涵体水平相差大于0.2)的盒式外显子。本文发现57个盒式外显子在间充质系和上皮系之间有差异表达，其中55个外显子可以通过IGV的可视化进行验证(图3A和C)。这些外显子包括一些以前在EMT中观察到的已知例子，例如Map3k7，Dnm2， Pard3中的上皮相关盒式外显子，以及间质相关外显子Plod2，Csnk1g3，和Ctnd1。本文接着使用ToppGene进行了基因功能富集分析(图3B)，发现含有这些外显子的基因与上皮特征(如钙粘附素结合或细胞连接)或间充质特征(如与细胞运动有关的片层脂质体或细胞前沿)有关。此外，富集分析指出，其中许多基因的剪接是由剪接调控因子esrp1和esrp2控制的。使用类似的分析，本文发现了除了盒式/跳跃外显子(SE)之外的其他类型的MET相关的选择性剪接事件。这些外显子包括互斥的外显子(MXE)，例如Fgfr2、Actn1和Tpm1。本文还在SRSF1基因中发现了一个保留内含子(RI)，该内含子在PODOs中相对于其他细胞群体表达水平更高。
三、监督分析发现在肾脏发育过程中经历剪接异构体转换的其他基因本文发现Fgfr2，Epb4115，Fat1，以及Arhgef10I主要在早期间充质表达（UM和CM）。Prox_1和Prox_2表达间质或上皮异构体，或两者兼而有之。有趣的是，本文观察到PODO在许多情况下表达间充质，而不是上皮异构体(图3A)。这揭示了形成一种特殊类型的上皮组织的PODOS与大多数其他形式的上皮不同的另一个方面。基因Enah和Cd44是在EMT过程中经历剪接异构体转换的突出例子。这两个基因都含有仅在上皮细胞中表达的盒式外显子。然而，在本文的单细胞数据集中很难观察到这种行为，可能是因为本文的单细胞方法相对于批量RNA测序有着相对较低的覆盖率和偏好性。因此，本文对SIX2-高和SIX2-低的细胞片段进行了额外的批量RNA测序。通过手动比较这两个细胞组分的Sashimi图，本文能够观察到Enah和Cd44基因中选择性剪接的盒式外显子。在Cldn10基因中观察到了一种与EMT无关的不同形式的选择性剪接，Cldn10是肾脏上皮紧密连接的重要组成部分，提供了一种允许选择性细胞旁运输的屏障。在本文的数据集中，观察到皮质异构体确实在位于皮质的prox_1和prox_2中高表达，而髓质异构体在主要位于髓质的LOH中高表达。这证实了之前的原位杂交也是在单细胞转录水平上进行的。还观察到两个已知的剪接异构体转换事件，基因Wt1是肾脏发育的核心基因：盒式外显子5在间叶性人群中较低，并在MET期间逐渐增加，外显子9中的KTS1+：KTS-异构体比率在上皮人群中达到60：40。 四、RNA结合蛋白的差异表达和RNA结合位点富集分析表明，Esrp1/2和RBFOX1/2是肾脏发育过程中MET的剪接调控因子接下来，本文使用rMAPS39鉴定了假定的RNA结合蛋白，这些蛋白在肾脏发育过程中作为剪接调节器在间质和上皮状态之间进行剪接异构体转换。首先比较了84个已知的RNA结合蛋白在间充质细胞(UM，CM)和上皮细胞(Prox_1，Prox_2，LOH，dist_CD)之间的平均表达水平，发现了几个可能的剪接调控因子有差异表达(图4A)。
在这些差异表达的RNA结合蛋白中，本文发现RBFOX1和RBFox2在间充质细胞中高表达，而Esrp1和Esrp2在上皮细胞中高表达(图4B)。同样发现RBFOX1/2和Esrp1/2具有RNA结合位点，这些RNA结合位点在盒外显子的5‘或3’相邻内含子中富集，这些内含子在间充质和表皮之间有差异表达(图4C和D)。这表明RBFOX1/2和ESRP1/2是参与肾脏发育过程中MET的剪接调节因子，类似于以前在EMT中观察到的：在间充质细胞群体中，RBFOX1和/或RBFox2与间充质相关盒外显子下游3‘侧内含子中的mRNA结合，并促进它们的包含性，而在上皮细胞群体中，Esrp1和/或Esrp2与下游3’侧内含子结合。
图5 RNA结合蛋白的差异表达和RNA结合基序的富集分析
陈述肾脏发育是一个复杂的过程，涉及多种相互作用和过渡的细胞类型。Drop-Seq单细胞技术测量了数千个单个细胞的基因表达，已经被用来表征这些作为器官发育基础的细胞分化变化。然而，许多基因的选择性剪接创造了额外的细胞异质性，这是Drop-Seq技术无法测量的。因此，在本研究中，利用全长单细胞RNA测序技术对小鼠胚胎肾脏的选择性剪接进行了研究，尤其是对从间充质细胞向上皮细胞转变过程中选择性剪接基因及其剪接调控因子进行了鉴定。这些结果提高了我们对肾脏发育的分子机制的理解。
参考文献
Single-Cell RNA Sequencing Reveals mRNA Splice Isoform Switching during Kidney Development. J Am Soc Nephrol. 2020;31(10):2278-2291. doi:10.1681/ASN.2019080770
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文：Tanbn&Anna
排版：市场部
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