为了保证细胞活力，单细胞测序最终的样品都是新鲜的单细胞悬液，且对样品的质量要求较高，如活性大于80%等。而且单细胞悬液制备一般需要专业的工程师来完成，但是最初的样品大多数是临床医生提供的临床样品，取样时间和单细胞悬液制备有一定的时间差，无法保证临床手术样本保持最原始组织细胞状态，对结果分析产生一定影响。小编带你回顾实验过程中的“坑”：遇到手术时间不确定，难以提前约到取样时间，仪器无法准时到达；肿瘤样本下手术台后无法立即送到实验室，需要经过短时间一段距离运输，无法完美保存组织状态；甚至下机后需要等待一段时间进行病理诊断选择样本取舍；医院没有合适的场地进行单细胞悬液制备的条件等。虽然这些“坑”都经历过了，为了避免老师遇到同样单细胞取材的问题，百迈客特推荐第二种方式采用组织保存液储存组织样本，既可以保持样本最原始组织活性状态，又可以解决样本难以获取以及批次性效应等问题，针对大部分组织样本比较合适采取种该方式，但对于一些特殊组织样本经过测试无法通过组织保存液储存保持组织原始状态（详细样本类型说明见下文）。接下来，我们就聊聊百迈客组织保存液使用指南那些事。组织保存液仅适用大部分组织类型，并非适用所有的组织类型。有些组织含有特殊的酶，运输过程中会导致组织状态发生改变，如何判断何种组织类型适用组织保存液寄送，这里你完全不需要担心，百迈客为您提供最真实的体验和数据测试，总的来说目前以下组织类型和肿瘤样本适合组织保存液寄送开展单细胞测序：
以上组织类型是否适用与组织保存液开展单细胞测序均经过大量测试，对于不适合的组织类型还是建议老师上门服务现场进行组织解离，一般这类组织比较特殊，比如眼睛、大脑、胃、胸腺、胰腺等不适合组织保存液寄送。其他未标明的组织，百迈客逐步测试优化中，老师也可以优先考虑组织保存液寄送进行预实验，选择最方便合适的方式获取单细胞测序样本。相信以上介绍让老师了解组织保存液在单细胞测序应用强大的性能和便利，那么我们该如何正确使用组织保存液才能保证组织样本最佳状态进行单细胞测序呢？这里有一份百迈客提供组织保存液使用指南：1）组织保存液应始终保持2-8°C的储存/运输温度，收到后4℃冰箱避光冷藏，避免冷冻；2）直接将清洗干净的样本切割成0.5cm-1cm左右的组织块，尽量不超过1cm,保证组织块能够充分接触组织保存液，放入加满组织保存液（2~8°C预冷）的离心管中，样本必须完全被组织保存液浸没；3）用于运输时，将离心管用封口膜封好，避免气泡，防止与空气长时间接触；4）2~8℃避光保存，可在48h内维持组织样本一定的胞存活率及完整细胞表位；5）避免样品管直接接触冰袋，外面必须包裹纱布或棉花，防止组织冻存；6）样品管上标注样品名称，取样时间精确到X时，在组织保存液储存最佳时间内保证最原始组织样本状态。如果文字不够清晰明了，这里还有为老师提供组织保存液使用视频指导，包你一学就会，一做就是发高分文章。
只要您在百迈客进行单细胞测序项目，组织保存液免费送，没错就是免费送。这个暑假百迈客陪您尽享夏季福利。
不仅如此，百迈客推出单细胞项目组织保存液送样返礼活动（只针对组织样本），只要您在百迈客进行单细胞测序项目采用保护液进行寄送样本，就可获得百迈客暑假组织保存液送样返礼活动，详情请咨询当地销售。活动时间7月13日-8月31日，最终解释权归百迈客所有。
那么组织保存液该如何选择呢？以及组保存液使用性能如何呢？下面给大家盘点组织保存液使用的强大性能，以及cell重量级期刊发表的组织保存液在乳腺癌中的单细胞测序应用，让我们来体验感受组织保存液的巨大优势。
美天旎组织保存液可以存储多种新鲜器官和组织，不会导致细胞活化或凋亡，防止干细胞和免疫细胞的活化，在人和小鼠的肿瘤、皮肤、心脏、脾脏、脑和心肌等组织上均进行过验证。话不多说直接上图看证据：特点
◆或许您已收集到新鲜样本，但是无法当场进行组织处理；
◆或许您需要收集不同时间点的样本，最后做多组处理；
◆又或者，您正在收集病人样本，需要凑足足够的数量来做有数学统计的研究。
涉及到单细胞组织取样难、处理环境难的时候，一旦收集到新鲜样本却无法立即处理时，如处理不当，细胞就会发生坏死和凋亡，影响其原有的功能特性，进而影响单细胞测序数据结果可靠性。Figure 1：Cells per gram of tissue comparison between MACS Tissue Storage Solution and competitor products
美天旎组织保存液处理过的组织解离后得到的细胞数基本高于其他品牌。
Figure 2：Viability comparison between MACS Tissue Storage Solution and competitors.美天旎组织保存液处理过的组织解离后的细胞活性明显高于其他品牌。原文链接：https://www.miltenyibiotec.com/CNen/products/macs-tissue-storage-solution.html一般常用美天旎组织保存液规格货号是MACS® Tissue Storage Solution:100mL;
此规格组织保存液一般可使用50个样本左右，完全满足一般实验所需。该储存液可以维持组织样本在长达48 h内的细胞存活率及完整细胞表位。
• 最佳的细胞存活率和产量，保持细胞表位信息完整。经过大量测试，CT26肿瘤在采集当天或在组织存储液中保存24、48小时后进行处理。解离后，流式细胞术检测肿瘤浸润性白细胞（TILs）的总细胞活力和组成。在新鲜和储存样本中，细胞存活率均超过85%。组织存储溶液保存细胞活力和TIL群体的组成，长达48小时的存储[1]。
Fig1A. CT26 mouse tumors were stored at 4 °C in MACS Tissue Storage Solution for 24 or 48 h. After dissociation, total cell viability此外，TILs的组成也随时间保存下来。通过分析活化标志物CD25、CD69、CD80和CD86在特定TIL群体中的表达，发现这些细胞的活化状态也被保存下来。基本上组织保存液使用48h后的组织解离检测到细胞群比例与新鲜组织相当，并不改变各种细胞类型比例。
Fig1B. TIL composition (B) were analyzed by flow cytometry另外，分子分析的一个主要问题是储存条件诱导细胞应激和基因表达的变化，通过分析细胞应激通路相关基因的表达来研究的。那么组织保存液使用过程中是否会引起部分应激表达呢？大量实验结果表明，与新鲜样品进行基因表达比较，保存24小时或48小时后，细胞中与应激相关的基因表达没有重大变化，且基因表达与新鲜样本的细胞相当。
Fig2. Expression of cellular stress-related genes in cells from freshand stored tumors细胞应激相关基因在新鲜和组织保存液储存肿瘤组织中的表达1）组织存储解决方案为不同组织样本和器官的短期存储提供了一个强大而方便的解决方案。2）细胞活力、细胞组成和细胞活化状态至少能保持48小时。3）组织存储溶液可以防止细胞应激反应，因为与新鲜样品相比，细胞应激相关基因表达水平的变化保持在最低水平。
2018年BMC Genomics研究比较了以组织保存液HTS-FRS为基础的单细胞低温保存技术，为单细胞测序对原代组织的高保真保存策略提供了指导[2]。研究人员使用流式细胞术比较了新鲜和组织保存液处理的小鼠肾脏细胞的存活率，并通过scRNA-seq分析，验证了保存液低温保存组织样本策略在长达3天（低温处理新鲜、6h、1天、2天、3天、4天）的保存过程中，能够有效保持肾脏的细胞群体异质性、转录组完整性和免疫细胞转录组稳定性。该研究表明，在4℃条件下，组织保存液能够完好保存原始样本，适用于进行较长距离运输。
组织保存液低温保存高保真保存细胞群体异质性和转录组完整性
同样，组织保存液是否对B/T淋巴细胞TCR/BCR的表达是否产生影响，改变淋巴细胞的特性性。进一步研究发现，组织保存液可以保留组织免疫细胞的转录组的稳定性，并且全长转录组测序表明在组织保存液中储存48h的组织中B淋巴细胞重链和轻链配对可与新鲜组织相当。
2020年Madissoon[3]等人在 Genome Biology 发表了组织保存液在肺、食管、脾脏组织中进行单细胞测序性能比较的研究。系统研究离体组织在组织保存液中低温保存后对单细胞转录组实验影响的文章，具有重要的指导意义，在设计单细胞实验的时候值得借鉴。
作者测试了三种人的组织：肺（n=5）、脾脏（n=5）和食管粘膜（n=6）。样本来源于器官移植后剩余的组织（距供体停止血液循环2小时左右），取样大小为0.5-2cm3，取样后将组织放置于组织保存液（HypoThermosol FRS，Sigma，H4416），4度保存，然后迅速转移至实验室。到实验室后，将样本分为四份，一份直接进行组织解离，作为0小时（距供体停止血液循环4小时左右），其他三份样本分别经过12、24和72小时低温保存后开始组织解离，采用10x scRNA-seq系统比较组织保存液在单细胞测序应用的性能。
结果表明组织内的RNA并没有在低温保存过程中发生明显降解；在组织保存液使用48h内线粒体比例跟新鲜组织相当，说明细胞状态比较完整；每种细胞类型的占比在不同样本或不同供体之间的差异很大，低温保存对单细胞实验的结果影响有限。
我们再来看看2019年Johanna Wagner[4]在cell上发表重量级组织保存液使用实际应用案例，文中一共收集了144例乳腺癌患者临床样本，要完成如此数量级别的肿瘤样本组织解离，就面临一个问题，手术样本无法长期保存，同时要尽快解离完避免批次效应，所以文中使用美天旎组织保存液完美解决这个问题。充分证明了组织保存液至少24h内可以保证高质量单细胞测序数据分析。总结：组织保存液使用性能
◆1）准确性:有效保持细胞群体异质性、转录组完整性和免疫细胞转录组稳定性；◆2）全面性：组织保存液低温存储策略可以最大限度地减少批次效应，防止一些细微的基因表达特征被掩盖；◆3）有效性：没有背景效应，如细胞活化或凋；◆4） 临活性：临床样本可灵活寄送，寄送验证过多种组织类型◆5） 最佳储存时间：48小时内可保证单细胞测序数据质量；参考文献
[1] Optimal storage of murine tumors in MACS® Tissue Storage Solution. 2020, www. miltenyibiotec.com.
[2] Wang W, Penland L, Gokce O, et al. High fidelity hypothermic preservation of primary tissues in organ transplant preservative for single cell transcriptome analysis. BMC Genomics. 2018 Feb 13;19(1):140.
[3] Madissoon E, Wilbrey-Clark A, Miragaia RJ, et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biol. 2019 Dec 31;21(1):1.
[4] Wagner J, Rapsomaniki MA, Chevrier S, et al. A Single-Cell Atlas of the Tumor and Immune Ecosystem of Human Breast Cancer. Cell. 2019 May 16;177(5):1330-1345.e18.
[5] Arazi A, Rao DA, Berthier CC, et al. The immune cell landscape in kidneys of patients with lupus nephritis. Nat Immunol. 2019 Jul;20(7):902-914.
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