单细胞分析和遗传分析揭示胃肠道Wnt通路调控机制
英文题目：Single cell and genetic analyses reveal conserved populations and signaling mechanisms of gastrointestinal stromal niches
发表杂志：NATURE COMMUNICATIONS
影响因子：:12.121
摘要
Wnt信号通路在促进胃肠道表皮再生和发育中具有功能保守性，但是胃部Wnt配体来源缺乏定论。研究通过单细胞转录组测序，在胃肠道中鉴别出了表达Wnt配体周细胞样基质细胞，阐释了Hh信号通路以及转录因子GLI2对这群细胞中Wnt信号通路的调控机制。该研究结果证明了胃肠道中的干细胞具有功能冗余性，从而保证消化道表皮细胞再生和发育。
研究结果
1.利用单细胞转录组测序鉴别出一类胃肠道基质细胞群——周细胞样基质细胞，其转录特征在胃和肠道中具有保守性
为了确定胃和肠基质细胞的异质性，从小鼠中分离出了胃肠道基质细胞,做单细胞转录组分析（胃4946个细胞，肠3459个细胞）。t-SNE分析确定了针对胃和肠的10多种不同的基质细胞簇（Fig.1a-d）。此外，本文的无监督分层分析确定了在胃和肠之间表达保守和不同的转录组特征的基质细胞簇(Fig.1e)。
2. 周细胞样基质细胞邻近上皮细胞，高表达特络细胞、周细胞标志物和Wnt配体，Hh信号通路表达活跃
为了确定胃基质细胞簇表达生态位信号, 用MAGIC分析Wnt表达。许多不同的基质细胞群表达Wnt配体和激动剂基因，表明Wnt生态位信号的潜在冗余来源。值得注意的是，与不同的细胞群相比，在胃和肠之间保守的基质细胞群对Wnt通路的富集程度更高，而一些不保守的基质种群也表达Wnt配体。此外，这些保守的细胞群中周细胞群标记物（例如Ng2（Cspg4）和Pdgfr-β）(Fig.2a,b)高表达。单细胞转录组分析表明，这些肠周膜细胞中已知标志物，例如CD34，Pdpn和Pdgfr- α在胃肠道间质细胞中广泛表达。为了验证Ng2在体内的表达，本文利用Ng2 + / DsRed和Ng2-Cre ; Rosa26 + / tdTomato 小鼠，并进行免疫荧光染色，本文发现在Ng2 +保守的基质细胞群中表达了周细胞标志物（Desmin，PDGFRβ和Nestin）和绒毛核心基质细胞标志物PDGFRα，但没有神经胶质细胞标志物（s100β和GFAP）表达。尽管这些细胞仍表达一些周细胞标记，但它们未能与CD31 +内皮细胞共定位，并表达了与胃肠周细胞不同的基因。因此，本文将它们称为周细胞样基质细胞。
FoxL1在构成关键的肠道干细胞生态位的细胞中表达，但尚未探讨它们在胃中作为干细胞生态位的作用。本文的分析表明Foxl1和Ng2（Cspg4）(Fig.2a-c)在胃和肠之间保守的细胞簇中具有高度重叠的表达模式。此外，单分子RNA荧光原位杂交分析证实了Ng2和Foxl1在体内的重叠表达(Fig.2f,g)。
3. 周细胞样基质细胞分泌Wnt配体、维持成体干细胞稳态
为了研究类周细胞样细胞群作为胃肠干细胞生态位的作用，本文分析了Ng2-Cre；Rosa26 + / mTmG小鼠，发现Ng2-Cre标记的GFP阳性基质细胞与腺体和隐窝周围的胃肠道上皮细胞非常接近。为了检查这些周细胞样细胞作为Wnt生态位信号的作用，本文在Ng2-Cre；Rosa26 + / tdTomato小鼠中进行了smFISH实验和定量RT-PCR，并证实了Wnt配体如Wnt2b和Wnt4的表达(Fig3b,c)。为了确定这些分泌Wnt的基质细胞作为干细胞利基的重要性，本文有条件地删除了Wntless，其对脂质修饰的Wnts 的分泌至关重要。虽然Ng2-Cre ;Wlsfl/fl 小鼠的肠道长度缩短，杯状细胞和潘氏细胞数量减少，表明Wnt信号传导水平降低，但是本文观察到胃肠道上皮细胞增殖没有显着变化(Fig.3d,e)。然而，以OLFM4和Lgr5标记的胃和肠干细胞数量均显着减少。
本文的单细胞测序和小鼠遗传分析首次证明，胃间质细胞在发育和再生过程中构成了关键的Wnt干细胞生态位。本文还证明了Hh下游转录因子GLI2直接诱导Wnt配体在胃中的表达。由于本文的单细胞分析是使用从腺后代中分离的基质细胞（包括includes体和胃窦）进行的，因此单独的单细胞分析将能够进一步定义胃区域特异性基质壁。
Ng2-Cre;Wls fl / fl标记的小鼠中的胃和肠干细胞数量减少，未发现增殖缺陷，并且它们能够正常繁殖，提示了微环境信号的其他来源。支持该观点的是，未用Ng2-Cre标记的其他基质细胞群表达了Wnt配体。考虑到周细胞样基质细胞与胃肠道上皮干细胞的接近性，它们在Wnt配体中的表达以及Wnt信号在干细胞更新中的作用，本文假设这些细胞中Wnt的分泌在再生过程中至关重要。
有趣的是，本文发现NG2标记的周细胞样基质细胞和上皮细胞Wnt2b中均表达，提示周细胞样再生期间基质细胞为关键(fig.4a-c)。为了解决这些胃和肠间质在再生中的特定作用，本文同时进行了对照和Ng2-Cre，并在10天后对它们进行了再生分析。与对照组相比，Ng2-Cre; Wlsfl / fl小鼠的胃和肠再生祖细胞和干细胞的存活和增殖均受到损害，证明了周细胞样基质细胞在再生过程中作为干细胞生态位的关键作用(Fig.4e-j)。虽然Ng2-Cre谱系标记的腹膜间皮细胞在正常的成人体内稳态中很少增生，但其辐照后其增殖显着增加。另外，本文还发现与上皮细胞相比，Ng2-Cre谱系标记的隐膜细胞具有放射抗性。有趣的是，据报道，Shh的表达在辐射后增加，并促进大脑中Shh介导的肿瘤发生。结果显示出对周细胞样基质细胞的需求，因为它是再生中的Wnt干细胞生态位。
Fig4.在再生过程中Ng2 +周细胞样基质细胞构成了关键的干细胞生态位
a. 出生后第32天进行全身照射和解剖的示意图。
b. smFISH，Ng2 -Cre;Rosa26+/tdTomato小鼠中Wnt2b（绿色）；在全身照射后48小时显示出其表达比非照射对照组显着增加
c.定量RT-PCR显示，与未照射的Ng2-tdTomato阳性细胞相比，在照射后，Ng2-Tdtomato阳性细胞中Wnt2b和Wnt4的表达水平增加
d.全身照射的时间表
e.照射后小鼠的体重变化
f .照射后10天内的生存曲线
g.与对照组相比，H＆E染色（左），BrdU（绿色）和SOX9（洋红色）的IF显示Ng2-Cre ; Wls fl / fl小鼠胃窦上皮增殖水平显着降低，Sox9祖细胞数减少。
h. 与对照组相比，Ng2-Cre；Wls fl / fl小鼠腔中CD44（绿色）和OLFM4（洋红色）的IF分别显示CD44 +和OLFM4 +干细胞的数量明显减少
i,h＆e. 染色（左）和BrdU（品红色）和αSMA（绿色）的IF显示，与对照组相比，Ng2-Cre; Wlsfl / fl小鼠回肠中BrdU +细胞的数量明显减少
j 与对照组相比，Ng2-Cre; Wlsfl / fl小鼠回肠中CD44（绿色）和OLFM4（洋红色）的IF分别显示CD44 +和OLFM4 +干细胞的数量明显减少。
4. Hh信号激活上皮细胞中Wnt通路、促进上皮再生
在单细胞RNA-seq数据中分析了Hh靶基因，发现与不同的基质细胞群体相比，在胃和肠之间保守的基质细胞群体的Hh通路高度富集(Fig.5a)。为了进一步研究Wnt通路传导的Hh调节，激活了Ng2-Cre标记的周细胞样基质细胞中的Hh信号传导，并检测到胃和肠上皮细胞增殖水平升高（Fig5b,c）。与Wnt信号在肠道分泌谱系分化中的作用一致，在发育过程中激活Hh后，杯状细胞的数量也显着增加（Fig.5d）。此外，smFISH分析显示这些小鼠中胃肠道间质Wnt配体表达水平增加，证明了Hh激活了间质干细胞小生境信号（图5e，f）。
5. Hh通路激活小鼠中，转录因子GLI2对Wnt配体的激活在胃和肠道中有机制保守性
Fig5.胃和肠之间转录因子GLI2对Wnt配体的激活
a. 富集网络。DKO胃和肠中相对于对照而言，基因上调了两倍的功能谱。左半圈：胃中基因集富集的意义。右半圈：肠道中基因组富集的意义。分析表明，大多数通路通常都在突变胃和肠道中富集。关键基因集：Hh信号，Wnt信号，BMP信号，干细胞发育，肌肉发育，细胞命运承诺，血管生成，后肠发育（仅肠），对机械刺激的反应（仅胃）。
b从DKO胃和肠中识别出的所有SE区域中H3K27ac ChIP-Seq信号的相关热图。该图显示了较高的组内相关性和相对较高的组间相关性，表明两种组织类型中的SE重叠。
c 在DKO胃和肠SE区的H3K27ac ChIP-Seq信号的MA图证实了相关热图中的发现。共有538个SE区域是常见的（两个组织之间的折叠富集<1.5）。映射到14个独特基因的16个区域是组织特异性的（倍富集> 2）
d来自GLI2，H2K27ac和H3K36me3 ChIP-Seq实验的信号显示了受GLI2调控的肠道（Hoxc8）-和胃（Nr2f1）特定区域的示例。
e在DKO胃和肠中的Gli2 ChIP-Seq鉴定出1100多个重叠区域
f对与1120个重叠Gli2峰相关的基因进行KEGG通路分析。在Hh，TGF-beta和Wnt信号通路中鉴定出显着的富集。
g来自GLI2，H2K27ac和H3K36me3 ChIP-Seq实验的信号显示了受GLI2调控的Hh信号（Ptch1）和Wnt配体（Wnt2b，Wnt9a）基因的示例。所有基因均在SE区域内，并与GLI2结合。
h，i验证从（h）Wnt2b和（i）Wnt9a位点附近的GLI2峰区域生成的萤光素酶报告片段的GLI2激活。
6. 抑制周细胞样基质细胞的Wnt分泌，导致胃肠道再生和发育受损
为了解决Wnt分泌型胃肠道间质细胞的这种潜在的冗余作用，本文使用Bapx1 + / Cre小鼠更广泛地靶向胃肠道间质细胞。 Bapx1 + / Cre; Wlsfl / fl小鼠在整个胃肠道表现出明显的严重表型。与在小鼠前庭胃中的Wnt信号激活观察一致，发育过程中的上皮组织4，Bapx1 + / Cre; Wlsfl / fl小鼠显示前庭胃的大小显着减少，同时上皮细胞增殖水平降低，同时适当地维持了胃-肠边界。另外，肠腔严重扩张，肠长明显减少。苏木精-曙红（H＆E）染色也显示上皮耗竭，绒毛数量明显减少。为了分析干细胞缺陷，本文对sgrFISH进行了Lgr5的检测，发现其在胃和肠中的表达均显着降低，表明发育中的干细胞存在严重缺陷。为了测量上皮Wnt信号传导活性，本文还分析了已知Wnt靶基因（如SOX9和CD44）的表达，并发现这些标记物显着减少。这些都依赖于Wnt信号传导的上皮增殖和分泌，细胞分化受到严重损害。这些数据表明胃肠道间质Wnt生态位信号在发育过程中的重要作用。
总结与讨论
综上所述，本文利用单细胞测序技术，不仅揭示了胃和肠间质干细胞保守的信号传导和转录机制，而且还揭示了间质细胞群中意外的冗余。更有趣的是，在许多不同的哺乳动物器官中都发现了端细胞。因此，这将有助于探讨Hh和gli2介导的Wnt配体激活是否也在其他器官的端细胞中保守。各种疾病的研究也可以采取相似的策略，选择单细胞和遗传分析揭示各种组织器官相关作用调控机制。
文：danny
排版：市场部
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