利用Seurat处理空间转录组数据
数据获取
data
|-- spatial
|-- filtered_feature_bc_matrix.h5
也可以下载原始数据自己进行处理。
原始数据处理
sapce ranger主要的功能：
spaceranger mkfastq ##将bcl数据转换成fastq数据
spaceranger count ##将fastq数据转换成空间特征矩阵
spaceranger aggr ##可以将同分组，同流程的样本进行合并处理思路大致如下：
space ranger结果包含许多结果：
├── analysis
├---├── clustering
│---├── diffexp
│---├── pca
│---├── tsne
│---└── umap
├── cloupe.cloupe
├── filtered_feature_bc_matrix ##需要的表达矩阵结果
│---├── barcodes.tsv.gz
│---├── features.tsv.gz
│---└── matrix.mtx.gz
├── filtered_feature_bc_matrix.h5 ##需要的表达矩阵结果
├── metrics_summary.csv
├── molecule_info.h5
├── possorted_genome_bam.bam
├── possorted_genome_bam.bam.bai
├── raw_feature_bc_matrix
│---├── barcodes.tsv.gz
│---├── features.tsv.gz
│---└── matrix.mtx.gz
├── raw_feature_bc_matrix.h5
├── spatial # 空间信息
│---├── aligned_fiducials.jpg
│---├── detected_tissue_image.jpg
│---├── scalefactors_json.json
│---├── tissue_hires_image.png
│---├── tissue_lowres_image.png
│---└── tissue_positions_list.csv
└── web_summary.html一般需要的是 filtered_feature_bc_matrix/filtered_feature_bc_matrix.h5结果，和对应的spatial空间信息文件。数据读取
利用Seurat包中的Load10X_Spatial函数进行读取。
##加载相关R包
library(Seurat)
library(patchwork)
library(tidyverse)
###数据读取
brain<-Seurat::Load10X_Spatial("data/")
ps:如果不设置filename参数的话，默认读取"filtered_feature_bc_matrix.h5" 文件
数据预处理
plot1 <- VlnPlot(brain, features = "nCount_Spatial", pt.size = 0.1) + NoLegend()
plot2 <- SpatialFeaturePlot(brain, features = "nCount_Spatial") + theme(legend.position = "right")
wrap_plots(plot1, plot2)
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需要对数据进行标准化处理，从而减少测序深度带来的影响。同时，因为组织中细胞的密度差异原因，使得数据存在异质性，所以需要进行有效Normalization，但是因为组织特异性的原因，常规的标准化方法（LogNormalize）不适用。
###对数据进行标准化处理
brain <- SCTransform(brain, assay = "Spatial", verbose = FALSE)
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基因表达的可视化
可以使用Seurat中的SpatialFeaturePlot函数来查看组织上的相关基因的表达情况
SpatialFeaturePlot(brain, features = c("Hpca", "Ttr"))
##未SCT标准化之前
##SCT标准化之后
##相关参数设置
pt.size.factor - 这将缩放spot的大小。默认是1.6
alpha - 最小和最大透明度。默认是c(0.1,1)#相关参数修改
p1 <- SpatialFeaturePlot(brain, features = "Ttr", pt.size.factor = 1)
p2 <- SpatialFeaturePlot(brain, features = "Ttr", alpha = c(0.1, 1))
p1 + p2
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降维、聚类、可视化
使用与scRNA-seq分析相同的工作流程，对空间转录组数据进行聚类。使用基于图形方法进行聚类。
brain <- RunPCA(brain, assay = "SCT", verbose = FALSE)
brain <- FindNeighbors(brain, reduction = "pca", dims = 1:30)
brain <- FindClusters(brain, verbose = FALSE)
brain <- RunUMAP(brain, reduction = "pca", dims = 1:30)(向左滑动查看更多)使用DimPlot函数或SpatialDimPlot函数对cluster进行展示和查看。
####可视化查看
p1 <- DimPlot(brain, reduction = "umap", label = TRUE)
p2 <- SpatialDimPlot(brain, label = TRUE, label.size = 3)
p1 + p2
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##查看特定类的情况
SpatialDimPlot(brain, cells.highlight = CellsByIdentities(object = brain, idents = c(2, 1, 4, 3, 5, 8)), facet.highlight = TRUE, ncol = 3)
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识别空间变量特征
##识别两个cluster中的差异基因
de_markers <- FindMarkers(brain, ident.1 = 4, ident.2 = 6)
SpatialFeaturePlot(object = brain, features = rownames(de_markers)[1:3], alpha = c(0.1, 1), ncol = 3)(向左滑动查看更多)
另一种方法是在没有预先注释的情况下，寻找显示空间模式的特征。利用FindSpatiallyVariables函数进行实现。
brain <- FindSpatiallyVariableFeatures(brain, assay = "SCT", features = VariableFeatures(brain)[1:1000], selection.method = "markvariogram")
###查看显著的基因
top.features <- head(SpatiallyVariableFeatures(brain, selection.method = "markvariogram"), 6)
SpatialFeaturePlot(brain, features = top.features, ncol = 3, alpha = c(0.1, 1))
暂时先介绍到这，如果有兴趣可以直接查看原文。https://satijalab.org/seurat/v3.2/spatial_vignette.html
参考资料：
Analysis, visualization, and integration of spatial datasets with Seurat
Seurat 新版教程：分析空间转录组数据
ST Pipeline: an automated pipeline for spatial mapping of unique transcripts
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