【文献精读】基质来源的外泌体miR21通过靶向APAF1促进卵巢癌细胞产生紫杉醇耐药性
外泌体RNA因其独特的特征，比如包裹癌源RNA的能力、在循环中的稳定性和可重复检测性，可以作为鉴定与疾病诊断、预后等相关的分子标志物，之前我们也跟大家分享了几篇外泌体RNA作为分子标志物的文章，比如可作为心脏结节病、早期胃癌的无创诊断分子标志物。而外泌体RNA研究除了分子标志物外，还有一类重要的研究方向—机理研究，比如肿瘤发生、发展机理，细胞间通讯和免疫方面等，今天就跟大家分享一篇外泌体miRNA细胞间通讯分子机制研究的文章。
研究背景
手术后铂类和紫杉醇类对卵巢癌患者在化疗初期有一定效果，但大多数患者会在12-24个月内复发，并逐渐死于化疗耐药疾病。
肿瘤进展的一个非常重要但经常被忽视的组成部分是肿瘤微环境，它主要由成纤维细胞、细胞外基质蛋白、内皮细胞和淋巴细胞浸润组成。肿瘤微环境已被证明可通过分泌蛋白、细胞与细胞的相互作用和基质重构直接影响细胞的生长、迁移和分化。由于它可以促进正常上皮细胞的肿瘤起始和恶性细胞的进展，肿瘤微环境提供了一个独特的机会来发现更好的诊断、理解和治疗癌症的方法。而其中的外泌体miRNA转移尤其有趣，因为miRNAs更稳定，可以控制受体细胞中多个靶基因的表达。此外，miRNAs已被证明可调节细胞分化、增殖和凋亡，并有助于多种肿瘤类型的发展。目前癌相关基质细胞的外泌体miRNA在调节受体癌细胞的恶性表型中的作用还未阐明。
在这项研究中，作者使用小RNA测序来识别分离自卵巢癌细胞和卵巢癌相关成纤维细胞(CAF)和脂肪细胞(CAA)外泌体中的差异miRNA，证明了特定的miRNA通过外泌体直接从CAF和CAA转移到卵巢癌细胞，确定了miRNA调节卵巢癌细胞中恶性表型的分子机制。
测序方法
样本来源：
成纤维细胞：来自于卵巢癌患者卵巢（CAF）3个样本；良性患者卵巢2个；
脂肪细胞：来自于卵巢癌患者卵巢（CAA）2个样本；良性患者网膜2个；
卵巢肿瘤细胞：4个样本（A2780、HeyA8、OVCA433 和SKOV3）；
以上细胞培养后梯度离心获得相应的外泌体，并进行鉴定。
测序方案：
测序策略：SE 50，测序量：平均9.1M。
研究结果
1
关键外泌体miRNA鉴定与筛选
从培养细胞上清液中分离外泌体，用电镜、qNano和WB对外泌体进行鉴定（图1a～b）。外泌体小RNA测序后，对miRNA进行鉴定，发现了miRNA的不同异构体，称之为isomiRNA(isomiR)，异构体包括3’剪接、5’剪接、3’ super和核酸替换等。
图1 a~c
对不同类型细胞中的miRNA进行表达量聚类分析表明，在卵巢癌细胞、成纤维细胞和脂肪细胞中miRNA转录存在差别(图1d)。在外泌体中鉴定到的miRNAs和isomiR中，miR21及其异构体最为丰富，一共有84种不同形式的miR-21 isomiR中，有8种在检测的所有细胞类型中都表达了。CAF和CAA外泌体中表达水平最高的是5‘-super-isomiR和成熟的5’- miR21。它们在正常卵巢成纤维细胞、CAF、正常脂肪细胞和CAA的拷贝数也比癌细胞中更高，其中在CAA中的拷贝数最高，表明CAA产生的外泌体miR21 isomiR最多，此外，qPCR验证结果与测序结果之间有很高的一致性（图1e、f）。
图1 d~f
为了确认CAA、CAF外泌体中miR21的高拷贝数是否是由于CAA、CAF中miR21表达显著高于卵巢癌细胞，作者对正常的脂肪细胞(NA)、CAA、正常成纤维细胞(NF)、CAF和卵巢癌细胞中miR21表达水平进行qPCR试验。结果表明，CAA和CAF的内源性miR21均明显高于卵巢癌细胞和正常基质细胞(图2a)。为了进一步证实miR21在卵巢肿瘤组织的基质和上皮中的差异表达，对从正常网膜组织分离出来的正常脂肪细胞、CAA、正常卵巢成纤维细胞、CAF以及从原代卵巢和网膜部位得到的卵巢癌细胞进行了qRT-PCR分析。结果表明，miR21在CAA中的表达水平最高(图2b)。此外，正常的脂肪细胞和正常的卵巢成纤维细胞表达的miR21水平最低，而网膜卵巢肿瘤表达的miR21水平高于原发性卵巢肿瘤(图2b)。
同时，作者又用原位杂交进行了验证。结果证实，正常的网膜脂肪细胞和成纤维细胞中miR21表达水平最低(图2c,d)。此外，在肿瘤细胞中基质-上皮交界处和侵入前端的miR21水平最高(图2e-g)，这表明miR21要么是由邻近基质细胞分泌的介质上调的，要么是直接从邻近细胞转移而来。复发性卵巢癌在卵巢癌组织基质和上皮中miR21表达水平明显高于原发性卵巢癌(图2i)。在体外实验中，在化疗耐药细胞系HeyA8和SKOV3中miR21表达水平高于其亲本细胞系HeyA8 MDR和SKOV3TR(图2j)。此外，复发性肿瘤细胞中miR21表达水平高于同一患者的原发性肿瘤细胞(图2k)。复发性或耐药性卵巢肿瘤细胞在体内的miR21增长倍数远远高于体内，这表明肿瘤微环境中的基质细胞通过直接转移miR21或可溶性介质的转录，增加了卵巢癌细胞中miR21表达水平。
图2
2
miR21的转移方式分析
为了确定miR21是否可以直接从CAA或CAF转移到卵巢癌细胞，作者将卵巢癌SKOV3ip细胞与瞬时转染FAM标记的miR21的CAF和CAA进行共培养。结果表明miR21从CAAs和CAF转移到癌细胞(图3a)。为了进一步说明miR21的转移是由外泌体介导的， 用CAF和CAA分离出的外泌体处理SKOV3ip细胞，结果证实了miR21是通过外泌体从CAAs和CAFs转移到卵巢癌细胞的(图3b)。
由于CAA外泌体的miR21含量比CAF高，所以验证了CAA外泌体是否可以转移更多的miR21到受体细胞。分别用相同数目CAA外泌体和CAF外泌体处理卵巢癌SKOV3细胞。qPCR结果表明，用CAA外泌体处理的SKOV3细胞中miR21的表达水平高于用CAF外泌体处理的细胞。这些数据表明，转移到受体细胞的miR21的数量取决于在外泌体中传递的miR21的数量。
为了确定在体内CAA产生的外泌体miR21是否能转移到卵巢癌细胞，在裸鼠皮下注射了标记了的卵巢癌SKOV3ip细胞(图3c)。在肿瘤结节形成后，用标记有FAM的miR21转染miR21-/miR21-小鼠胚胎成纤维细胞(miR21-/miR21- MEF)(图3d)，并在肿瘤结节旁注射。结果表明，在体内miR21可以从基质成纤维细胞转移到癌细胞（图3e～g）。
图3
此外，作者还用了一个TGF- b处理及qPCR试验排除了TGF-b（一个重要的癌—基质互作调节因子）对癌细胞miR21的作用，证明了癌症细胞中miR21表达水平的增加主要是由于miR21通过外泌体直接从微环境中的相邻间质细胞转移，而不是TGF-b刺激。
3 外泌体miRNA对癌细胞的作用
作者通过MTT试验等，对体内外miR21对卵巢癌细胞的增殖、运动和侵袭的影响进行研究，结果表明，miR21对癌细胞的增殖没有影响，但可以刺激癌细胞运动和侵袭。
作者用等量的miR21-/ miR21- MEF和miR21+/ miR21+MEF处理卵巢癌细胞系OVCA432和SKOV3后，miR21+/ miR21+MEF外泌体处理的细胞中miR21表达水平更高(图4)。进一步用紫杉醇处理细胞后，miR21-/ miR21-MEF外泌体处理细胞的细胞数量显著减少(图4 )。此外，pre-miR21转染的OVCA432和SKOV3的细胞凋亡率降低(图4)，且另外两个表达水平最高的miR21异构体的过表达也对卵巢癌细胞具有同样的生物学效应。最后，作者通过体内注射试验，发现miR21-MEF组肿瘤细胞的紫杉醇耐药性比单独注射SKOV3ip细胞组和MEF组更强(图4 f,g)。
图4
4 外泌体miR21促进卵巢癌细胞耐药性的作用机制
为了确定miR21使卵巢癌细胞产生耐药性的分子机制，作者对pre-miR21或阴性对照转染的SKOV3细胞进行芯片转录组分析。并通过通路分析确定了一组与耐药性相关的基因(图5a、b)，在这些基因中，作者选择了与耐药性和凋亡相关的APAF1进行进一步的验证研究。然后，作者通过CAA和CAF外泌体孵育卵巢癌细胞、转染miR21，并用qPCR、免疫组织化学、WB试验等确定了miR21确实对APAF1的表达有抑制作用（图5c~h）。
为了确定APAF1是否为miR21的直接靶标，作者使用RNA22软件确定了miR21序列与APAF1全长的一致性。结果表明，不同物种间具有显著同源性的APAF1编码序列是miR21的潜在靶标(图5i)。随后，潜在的miR21结合序列被克隆到荧光素酶载体中，并转染到OVCA432细胞中。结果显示，转染pre-miR21的细胞荧光素酶活性呈现显著的剂量依赖性降低(图5j)。此外，当突变APAF1编码序列转染细胞时，pre-miR21对荧光素酶活性的影响被消除(图5k)。这些数据表明，miR21通过与APAF1编码序列结合直接控制APAF1 的表达，APAF1是miR21的直接靶标。
图5
为了确定高水平的APAF1是否会影响卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性，作者将APAF1载体转染到卵巢癌细胞，并对其进行不同浓度紫杉醇处理，结果表明APAF1可以增强卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。为了确定APAF1的上调是否可以消除卵巢癌细胞中miR21赋予的紫杉醇耐药性，作者分别用pre-miR21和APAF1或pre-miR21和空载体转染卵巢癌细胞，结果表明APAF1可以部分消除紫杉醇耐药性(图6)，表明miR21除了通过抑制AFAP1影响卵巢癌细胞紫杉醇耐药性之外，还可能涉及其它机制。之后，作者通过裸鼠注射试验评估了在体内APAF1对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的作用，结果表明APAF1影响卵巢癌细胞的紫杉醇耐药性。
图6
结论
这篇文章研究结果表明，外泌体miR21可以从邻近基质细胞转移到卵巢癌细胞中，使其产生抗药性和侵袭性表型，这表明阻止miR21从基质细胞外泌体转运是抑制卵巢癌生长的一种新策略。此外，确定了APAF1是miR21的直接靶标，是miR21在卵巢癌中赋予抗药性的媒介，这表明基于在卵巢癌细胞中上调APAF1的策略可以用于提高卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。
参考文献：
Chi Lam Au Yeung, Ngai-Na Co1, Tetsushi Tsuruga1, et al. Exosomal transfer of stroma-derived miR21 confers paclitaxel resistance in ovarian cancer cells through targeting APAF1.NATURE COMMUNICATIONS. 2016.
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