【实用帖】常见医学样品RNA提取制备方法
核酸（nucleic acid）在生物界中堪称主宰，是一类非常重要的生物大分子，它在生物的繁衍、发育、维持、衰老和死亡等一切生命活动中扮演着重要的角色，如果其结构出现稍许的变动，比如一个碱基的差错、缺失或增加，就有可能导致突变、缺陷或疾病的出现，所以核酸已成为生物化学、遗传学以及其它有关生命学科的热门研究课题，其覆盖面之广、进展之速为其它学科所望尘莫及。而进行核酸研究的第一个前提就是能够将核酸从众多纷繁复杂的生物大分子中提取出来，并纯化到一定程度，以便进行相应的科学研究和实际应用。
在此与大家分享核酸提取样品制备、提取方法及检测方面的知识，以期能够对大家的科研有所帮助。
1
全血样品
01
采集血液进行检测面临的一个主要问题就是细胞内RNA的不稳定性，RNA在采血后数小时内便会迅速降解。此外，某些种属的RNA在采血后会通过基因诱导在体外增加。体外RNA降解和基因诱导均可导致体内相关基因的转录本数目低估或高估。
BD公司的PAXgene血液RNA管内含能够稳定体内基因转录性状的添加剂，它能够减少体外RNA的降解，并将基因诱导的水平降低到最小程度，适用于人和灵长类动物全血样品制备，对于全血样品，我们只推荐使用此管送样。
BD PAXgene血液RNA管（货号762165）
02
使用PAXgene血液RNA管前，请仔细阅读产品说明书，以便进行正确的操作。如果PAXgene血液RNA管为唯一的抽血管，则将血液抽入PAXgene血液RNA管之前应先抽血入“废弃管”内，使抽血过程中所用的采血器内能被血液预灌注；否则PAXgene血液RNA管应为抽血程序中的最后一只试管。确保血液已停止流入试管再从持针器上取下试管（PAXgene血液RNA管内的负压设计可向管内抽2.5ml的血）。
采血后应立即将PAXgene血液RNA管轻轻地颠倒8-10次，以确保管内保护剂和血液充分混合均匀。
03
将PAXgene血液RNA管竖直置于室温（18-25℃）静置2-24小时，之后可贮藏于-20℃或更低温度；若试管要贮藏于低于-20℃的温度，先在-20℃冷冻24小时，然后再将其转移到-70℃或-80℃，可保存至少50个月。大体积干冰运输。
2
血清血浆样品
由于细胞内含有的RNA的丰度远高于血液中游离的RNA，即使极少量细胞的存在也会对血液中游离RNA的分析造成很大影响。故去除细胞和细胞碎片的污染是血清血浆样品制备过程的关键。
01
采血管选择
对于血清样品，使用普通血清真空采血管即可；对于血浆样品，推荐使用EDTA抗凝管，禁止使用肝素类抗凝管。
02
使用EDTA抗凝管采集血液样品（采集后的血液样品可置于室温或4℃短暂保存，但不得超过1h）。1900g（或3000rpm），4℃，离心10min。小心转移上层血浆（黄色）至新的1.5ml离心管中，枪头不要触碰中间层（白细胞和血小板层）。一般情况下，10ml的血液可分离出4-5ml血浆。将分离出的血浆16000g，4℃，离心10min。枪头不要触碰到管底一侧的杂质，小心转移上清到一个新的1.5ml离心管中，-80℃保存。大体积干冰运输。
血浆样品分离
03
使用含凝血激活剂的采血管或普通真空采血管采集血液样品，室温静置10-60min使血液凝集。1900g（或3000rpm），4℃，离心10min。小心转移上层血清（黄色）至新的1.5ml离心管中，枪头不要触碰中间层（白细胞和血小板层）。一般情况下，10ml的血液可分离出3-5ml血清。将分离出的血清16000g，4℃，离心10min。枪头不要触碰到管底一侧的杂质，小心转移上清到一个新的1.5ml离心管中，-80℃保存。大体积干冰运输。
血清样品分离
3
细胞上清
使用合适的容器收集细胞培养液或其它生物液体。3000g，4℃，离心15min。小心转移上清液至新的无菌离心管中。将分离出的细胞上清液16000g，4℃，离心10min。枪头不要触碰到管底一侧的杂质，小心转移上清到新的无菌离心管中，-80℃保存。大体积干冰运输。
细胞上清分离
4
外泌体样品
对于老师自己富集好的外泌体，需要将外泌体溶解在不大于100ul RNase-free的PBS中并充分混匀，以方便后面提取。外泌体样品溶液置于-80℃保存。大体积干冰运输。
5
组织样
用于提取RNA的医口组织样，如果样品量较小，建议优先选择保护液（RNAlater等）送样方式。
用解剖刀将新鲜组织切成长宽高均≤0.5 cm的样本，小器官如鼠肝、肾和脾可以完整的保存在RNAlater中。将组织样本浸入5-10倍体积的 RNAlater中，以使组织完全浸没。将样本置于4℃孵育过夜（以使 RNAlater 完全渗透组织），然后转移至-80 ℃长期保存。大体积干冰运输。
取下新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型，如果组织体积较大，应尽量将组织切成长宽高均≤0.5 cm 的小块（即黄豆大小）。迅速用预冷的PBS溶液（RNase free）或生理盐水将组织表面的残留血液冲洗干净。将处理好的组织样本混合均匀后保存于旋盖的液氮预冷冻存管中。迅速置于液氮中冷冻约3h，然后转移至-80 ℃长期保存。大体积干冰运输。
注意事项：
1. 对于RNA类项目的癌症样品，我们建议手术取下的组织迅速放入RNAlater中，4℃孵育24小时，然后弃掉RNAlater，切下坏死区的组织以及癌旁组织，转入旋盖的液氮预冷冻存管中，液氮速冻，-80℃保存，干冰运输。
2. 组织样品离开活体后，建议在3min内进行液氮速冻，速冻前操作时间越长，RNA降解的可能性越大。
3. 组织样不建议使用TRIzol送样，如必须，需充分液氮研磨后溶于适量TRIzol中，组织样品切勿过量，常温裂解5min后，-80低温冻存，干冰运输。
6
细胞样品
一次RNA提取反应所需细胞数≤1×10^7个，以3×10^6—1×10^7个为宜。样品量较大的话，建议按上述要求将细胞样品分装至不同的管中。
01
贴壁细胞
从培养箱中取出贴壁培养的细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好（正常细胞融合度在80%左右）。弃去培养基，向细胞培养瓶或培养皿中加入5mL PBS（RNase-free，室温）洗一次。弃尽PBS，加入适量TRIzol，反复吸打数次；直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于裂解液中形成清亮不粘稠的液体。将裂解好的细胞溶液转移至 1.5 mL 旋盖离心管（ RNase-free ）中，置于-80 ℃长期保存，大体积干冰运输。
02
悬浮细胞
首先要确定细胞生长状态良好；离心得到细胞沉淀（依据客户实验室细胞离心步骤，注意细胞离心要适度，不要使细胞离心过实而造成裂解液不能充分渗透）。弃去培养基，加入 1 mL PBS（RNase free，室温），轻轻将细胞沉淀悬起， 转移至2 mL 旋盖尖底离心管（RNase free）中。离心（依据客户实验室细胞离心步骤，注意细胞离心要适度，不要使细胞离心过实而造成裂解液不能充分渗透）得到细胞沉淀，弃去PBS，加入适量TRIzol中，反复吸打数次，直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于裂解液中。置于-80 ℃长期保存，大体积干冰运输。
注意事项：
1. 如果是DNA项目普通灭菌PBS清洗即可，如果是RNA项目必须是RNAse-free的。
2. 获取细胞不建议用胰蛋白酶处理，胰酶为蛋白，如果有残留的话会影响后续实验。
3. 细胞数量低于5×105建议速冻直接送样（不用裂解液裂解），由于细胞数少，我们会安排微量提取。
4. 细胞类样品不建议保存于RNAlater类组织RNA保护液中送样，因为RNAlater密度大，保存于其中的细胞难于再离心收集用于提取。
延伸阅读
◆【干货分享】CorelDRAW教程、素材及问题快查资料--限时免费下载
◆【文献精读】用于循环外泌体小RNA表达谱分析的商业化外泌体分离试剂盒比较